Konformacijske spremembe človeškega α-aktinina-1 ob vezavi kalcijevih ionovTitovšek, David (Avtor) Djinović Carugo, Kristina (Mentor) α-aktinin-1kalcijkonformacijske spremembeomejena proteolizakristalizacijaα-aktinin-1 je eden izmed najpomembnejših proteinov, ki prečno povezujejo aktinske filamente v stresnih vlaknih in fokalnih stikih. Vsebuje 4 motive EF-roke, ki skupaj tovorijo kalmodulinu podobno domeno (CaMD), a le EF1 lahko veže kalcijev ion. Raziskave kažejo, da vezava iona Ca2+ na α-aktinin-1, zmanjša njegovo sposobnost prečnega povezovanja aktinskih filamentov in predstavlja način regulacije njegovega delovanja. Nedavno je bil na podlagi dosedanjih raziskav oblikovan model regulacije α-aktinina-1 s kalcijem. Ta predpostavlja, da ob vezavi iona Ca2+ α-aktinin-1 zasede bolj zaprto konformacijo, kjer se CaMD veže na povezovalni peptid med vezavno domeno za aktin in domeno s spektrinskimi ponovitvami. To α-aktininu-1 onemogoči povezovanje aktinskih filamentov v paralelne ali antiparalelne snope, a natančen mehanizem na molekularni ravni še ni poznan. Da bi ovrednotili predlagani model, smo izvedli omejeno proteolizo divjega tipa α-aktinina-1 (zaprta oblika) in mutanta z onemogočeno vezavo kalcijevih ionov (odprta oblika). Proteoliza s tripsinom je pokazala, da je α-aktinin-1 bolj odporen na razgradnjo v prisotnosti kalcijevih ionov, kar se sklada s predpostavljenim modelom. Tudi pri proteolizi s termolizinom smo opazili razlike v cepitvenem vzorcu med holo (z vezanim Ca2+) in apo (brez vezanega Ca2+) obliko, a vezave CaMD na povezovalni peptid na podlagi rezultatov nismo mogli ovrednotiti, zato so za potrditev modela potrebni nadaljnji eksperimenti. Da bi dodatno ovrednotili konformacijske spremembe na molekularnem nivoju, smo pripravili konstrukte polovičnega dimera α-aktinina-1 in njegove mutante z zmanjšano površinsko entropijo za kristalizacijo. Proteinske kristale holo (s Ca2+) in apo (brez Ca2+) oblike α-aktinina-1 smo pripravili z mutantom polovičnega dimera z zmanjšano površinsko entropijo (mutaciji K79A in E81A). Pridobljeni kristali bodo omogočili določitev kristalne strukture α-aktinina-1 z in brez vezanega Ca2+ z rentgensko difrakcijo.20212021-09-23 13:20:00Magistrsko delo/naloga131193sl