Vzpostavitev metode za vzbujanje oksidativnega stresa v algi Chlamydomonas reinhardtii s svetlobo UVKudelić, Sumeja (Avtor) Klemenčič, Marina (Mentor) Chlamydomonas reinhardtiiregulirana celična smrtoksidativni stresUV-svetlobaosmotski stresmetakaspazeRegulirana celična smrt (angl. regulated cell death, RCD) je na nivoju genov uravnavan proces, ki pri rastlinah omogoča kontrolirano rast in prilagoditev na stresne pogoje. Pred kratkim je bilo pokazano, da tudi pri enocelični zeleni algi Chlamydomonas reinhardtii pod določenimi stresnimi pogoji pride do procesov, ki so podobni regulirani celični smrti v kopenskih rastlinah. Alga C. reinhardtii je modelni organizem za raziskovanje različnih fizioloških procesov kot so fotosinteza, respiracija, prilagoditev na različna sevanja, osmotski in oksidativni stres. Pri C. reinhardtii lahko regulirano celično smrt opazimo pri več stresnih pogojih, kot so dodatek vodikovega peroksida ali ocetne kisline, značilnosti RCD pa lahko opazimo tudi po obsevanju z UV-svetlobo. Izpostavljenost celic C. reinhardtii različnim sevanjem povzroči morfološko značilne spremembe, kot so povečanje volumna vakuol, lestvičenje DNA (angl. DNA laddering) in prisotnost fosfatidilserina na zunanji strani celične membrane. Ker mehanizmi, ki privedejo v regulirano celično smrt pri tem organizmu še niso jasni, smo želeli vzpostaviti novo metodo za vzbujanje oksidativnega stresa v C. reinhardtii. Celice C. reinhardtii smo zato različno dolgo obsevali z UV-svetlobo, da bi ugotovili pri kakšni izpostavitvi sevanja pride do procesov povezanih z RCD. Parametri, ki smo jih spremljali pri celicah, obsevanih z UV-svetlobo, so preživetje celic po obsevanju ter nukleazna in proteolitična aktivnost. Opazovali smo tudi morfološke spremembe s svetlobnim mikroskopom. Ugotovili smo, da pride do povečanja volumna vakuol v celicah, ki so bile daljši čas izpostavljene stresorju. Z agarozno gelsko elektroforezo smo preverjali aktivnosti nukleaz, ki razgrajujejo genomsko DNA na urejene fragmente enakih velikosti DNA. Nastanek urejenih fragmentov DNA je namreč značilen znak, da je prišlo do RCD. Z izvedbo encimskega testa smo preverjali aktivnost tripsinu podobnih proteaz, za katere sklepamo, da so ključne pri RCD. Na žalost smo izbrali precej kratek čas obsevanja celic z UV-svetlobo in nespecifičen substrat (Z-FR-AMC), zaradi česar razlik v aktivnosti proteaz nismo opazili.20212021-09-13 13:35:00Diplomsko delo/naloga130310sl