Izolacija in karakterizacija proteina VaaMPIII-3 iz modrasovega strupaPožek, Kity (Avtor) Križaj, Igor (Mentor) Župunski, Vera (Komentor) modras (Vipera ammodytes ammodytes)strupmetaloproteinazedisintegrinom podobni/s cisteini bogati proteiniinhibitorji agregacije trombocitovStrup modrasa (Vipera ammodytes ammodytes) je kompleksna mešanica farmakološko aktivnih molekul. Med najbolj zastopane strupne proteine sodijo metaloproteinaze. VaaMPIII-3 je prvi predstavnik novega podrazreda metaloproteinaz P-IIIe. Sestavljen je iz dveh nekatalitičnih domen – skrajšane domene, podobne disintegrinom (D'), in domene, bogate s cisteini (C). Toksini s podobno domensko zgradbo med drugim vplivajo na strjevanje krvi. Lastnosti in delovanje VaaMPIII-3 še niso bili znani, zato smo se ga namenili izolirati in okarakterizirati ter raziskati njegov vpliv na strjevanje krvi. V sklopu magistrskega dela smo razvili in optimizirali postopek za izolacijo VaaMPIII-3 iz surovega modrasovega strupa. Potrdili smo, da ima VaaMPIII-3 prost cisteinski ostanek, ki omogoča vezavo na tiolno sefarozo in izolacijo s kovalentno kromatografijo. Pogoje izolacije smo prilagodili ugotovitvam o optimalni sestavi pufrskih raztopin za shranjevanje VaaMPIII-3 in se tako izognili izgubam zaradi obarjanja. Izolirali smo mešanico šestih izooblik VaaMPIII-3, z izoelektričnimi točkami med 4,5 in 5,1. Do homogenosti smo očistili prevladujočo izoobliko z izoelektrično točko 4,5. Prosti cistein smo lokalizirali na mestu 6, v manjši meri pa tudi na mestu 19 v molekuli VaaMPIII-3. Ugotovili smo, da se VaaMPIII-3 po razporeditvi disulfidnih vezi v domeni D' razlikuje od metaloproteinaz razreda P-IIIa. Pripravili smo tridimenzionalni strukturni model VaaMPIII-3. Ugotovili smo, da ima VaaMPIII-3 podoben vpliv na strjevanje krvi kot drugi proteini z enako domensko zgradbo. Zavrl je agregacijo trombocitov, sproženo z ADP, kolagenom ali arahidonsko kislino, ni pa imel vpliva na aglutinacijo trombocitov, sproženo z ristocetinom. V bakteriji E. coli smo izrazili rekombinantni protein VaaMPIII-3, ga izolirali, okarakterizirali in njegove lastnosti primerjali z naravnim. Molekulski masi naravnega in rekombinantnega VaaMPIII-3 se razlikujeta za približno 4 kDa, kar gre na račun N-glikozilacije prvega. Rekombinantni VaaMPIII-3 ima izoelektrično točko pri pH 5,1 in je pravilno zvit. Enako kot naravni protein je zavrl agregacijo trombocitov, sproženo z ADP. Kaže, da je rekombinantna oblika VaaMPIII-3 primeren nadomestek za raziskovanje bioloških učinkov naravnega VaaMPIII-3, kar bo vsekakor pospešilo pojasnjevanje njegove vloge v delovanju kačjega strupa in ugotavljanje njegove terapevtske uporabnosti.20212021-09-13 09:10:00Magistrsko delo/naloga130294sl