Izolacija osteopontina in glikomakropeptida iz sirotkePetelin Zadnik, Jana (Avtor) Bogovič Matijašić, Bojana (Mentor) sirokaproteiniglikomakropeptidosteopontinizolacija proteinovkromatografijaRazvili smo postopek osamitve proteinov glikomakropeptida (GMP) in osteopontina (OPN) iz različnih frakcij mikrofiltrirane kisle in sladke sirotke z uporabo ionske izmenjevalne kromatografije z monolitnimi kolonami (CIMmultus-QA-1mL), na preparativnem nivoju (do 150 mL). Proteina smo sprva ločili na osnovi naboja z anionsko-izmenjevalno kromatografijo. Oba proteina se na kolono QA vežeta pri pH izvorne sirotke (pH sladke sirotke 6-7, pH kisle sirotke 4,7) in pri pH = 5,0 (pri pufru, ki vsebuje natrijev acetat). Pridobljene frakcije s proteinoma GMP in OPN smo zatem analizirali na osnovi hidrofobnosti, s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti z obrnjeno fazo (RP-HPLC). Z metodo z gvanidinijevim hidrokloridom (GvHCl), ditiotreitolom (DTT), acetonitrilom (ACN) in trifluoroocetno kislino (TFA) smo proteina ločili od ostalih sirotkinih proteinov (α -LA, β-LG, BSA in kazeini). Sledila je še analiza na osnovi velikosti in vsebnosti sialične kisline s poliakrilamidno gelsko elektroforezo v prisotnosti detergenta natrijev dodecilsulfat. Z uporabo barvila »stains-all« smo vpeljali specifično metodo detekcije proteinov, ki vsebujejo sialično kislino. Ta metoda je omogočila ugotavljanje vsebnosti in čistosti osteopontina in glikomakropeptida, saj barvilo obarva proteine, ki vsebujejo sialično kislino, modro, ostale pa roza. Za boljšo interpretacijo dobljenih rezultatov pa smo dodatno izvedli še barvanje s koloidnim srebrom. Nismo pa uspeli natančno ugotoviti čistosti izoliranih proteinov. Z opravljenim delom smo na tri različne načine uspešno zaznali proteina GMP in OPN. Pokazali pa smo tudi, da je pridobivanje obeh proteinov primerno za industrijsko raven, kar potrjuje njuno komercialno zanimivost ter uporabnost v živilskih panogah. Slednje je zanimivo tudi s stališča nadaljnje izrabe sirotke in zmanjšanja negativnega vpliva gospodarjenja z odpadno sirotko na okolje.[J. Petelin Zadnik]20212021-09-12 07:16:42Magistrsko delo/naloga130255sl