<?xml version="1.0"?>
<rdf:RDF xmlns:rdf="http://www.w3.org/1999/02/22-rdf-syntax-ns#" xmlns:dc="http://purl.org/dc/elements/1.1/"><rdf:Description rdf:about="https://repozitorij.uni-lj.si/IzpisGradiva.php?id=129950"><dc:title>Priprava rekombinantnega proteina BirA</dc:title><dc:creator>Gašperšič,	Laura	(Avtor)
	</dc:creator><dc:creator>Turk,	Boris	(Mentor)
	</dc:creator><dc:subject>AviTag</dc:subject><dc:subject>biotinilacija</dc:subject><dc:subject>BirA</dc:subject><dc:description>Encim BirA iz E. coli seva K12 spada med biotin protein ligaze (BPL), ki katalizirajo pripenjanje biotina na tarčne proteine. Uporabljamo ga lahko za biotinilacijo proteinov ter služi kot alternativa biotinilaciji s kemijskimi reagenti. Pri kemijski biotinilaciji lahko pride do večkratne biotinilacije tarčne molekule na različnih aminokislinskih ostankih, z uporabo encima BirA pa biotinilacija poteče le na enem lizinskem aminokislinskem ostanku znotraj 15 ak dolgega zaporedja. To tarčno zaporedje (GLNDIFEAQKIEWHE) imenujemo AviTag in ga lahko z uporabo molekulskega kloniranja dodamo na N- ali C-konec tarčnega proteina ali znotraj izpostavljene zanke proteina. Z uporabo BirA in AviTag-a lahko specifično biotiniliramo tarčne proteine, ki jih lahko uporabimo v nadaljnjih eksperimentalnih metodah. Zaradi zelo močne vezave biotina s (strept)avidinom lahko biotinilirane tarčne proteine očistimo, multimeriziramo, lokaliziramo v celici ali imobiliziramo. Z eksperimentalnim delom diplomske naloge nam je uspelo pripraviti aktiven rekombinantni protein BirA, ki biotinilira tarčne proteine z AviTag-om. Najprej smo z molekulskim kloniranjem pripravili vektor, na podlagi katerega smo v celicah E. coli BL21[DE3] inducirano izražali rekombinantni protein His6-MBP-3C-BirA. V topni frakciji je bila zadostna količina izraženega proteina, zato smo za nadaljnje delo uporabili le topno frakcijo. Iz kompleksne mešanice topne frakcije smo z uporabo Ni-afinitetne kromatografije in gelske filtracije očistili rekombinantni protein od preostalih komponent. Nazadnje smo dokazali, da je pripravljen in očiščen rekombinantni protein tudi aktiven in katalizira biotinilacijo substrata, fuziranega z AviTag-om. Za substrat smo uporabili mišji katepsin S (mCTSS) z AviTag-om. Po inkubaciji substrata in encima v prisotnosti ustreznih reagentov smo z NaDS-PAGE elektroforezo in prenosom western na membrani zaznali prisotnost biotinilacije. S tem smo dokazali aktivnost pripravljenega encima BirA, ki ga bo v prihodnje mogoče uporabljati za biotinilacijo substratov z AviTag-om.</dc:description><dc:date>2021</dc:date><dc:date>2021-09-09 12:00:01</dc:date><dc:type>Diplomsko delo/naloga</dc:type><dc:identifier>129950</dc:identifier><dc:language>sl</dc:language></rdf:Description></rdf:RDF>