Optimizacija reakcije RT-LAMP za detekcijo SARS-CoV-2 v slini.Rajh, Eva (Avtor) Benčina, Mojca (Mentor) Gunčar, Gregor (Komentor) Ključne besede: RT-LAMPSARS-CoV-2diagnostična metodaKonec leta 2019 so se v provinci Wuhan na Kitajskem pojavila prva poročila o izbruhu novega koronavirusa, poimenovanem SARS-CoV-2. Virus se je hitro razširil po celem svetu in predstavlja eno največjih globalnih zdravstvenih kriz 21. stoletja. Množično testiranje populacije je ključno za ustavitev širjenja pandemije covid-19. RT-qPCR, ki je zlati standard molekularnih diagnostičnih orodij, ima omejitve, ki so predvsem zaradi povečanih potreb po testiranju postale očitne. RT-qPCR je dolgotrajen, zahteva dobro opremljen diagnostični laboratorij in v primeru množičnega testiranja, pri katerem se vsi zanašamo na isto metodo, lahko pride do primanjkljaja komercialnih reagentov in opreme. Zaradi preprostosti uporabe, hitrosti in ker za reakcijo ne potrebujemo hitrega spreminjanja temperature, je metoda obratne transkripcije in z zankami posredovanega pomnoževanja (RT-LAMP) zanimiva alternativa klasičnemu testiranju RT-qPCR. Slina je v primerjavi z nosno žrelnimi vzorci preprostejša za odvzem in neinvazivna, vendar vsebuje motilce in inhibitorje encimov RT-LAMP in RT-qPCR. Cilj raziskave je bil oblikovati diagnostično metodo na osnovi kolorimetričnega RT-LAMP za hitro detekcijo SARS-CoV-2 s prostim očesom v vzorcu sline brez izolacije virusne RNA. Optimirali smo sestavo vzorčnega pufra, reakcijske pogoje enostopenjske reakcije RT-LAMP ter določili analitično občutljivost in specifičnost metode. Vzporedno smo optimirali še metodo RT-qPCR za detekcijo virusne RNA na vzorcih neobdelane sline. Diagnostična metoda je hitra in od začetka procesiranja vzorcev do rezultata traja le 50 minut. Ugotovili smo, da je ključna komponenta vzorčnega pufra RNA stabilizacijski pufer. Z inhibitorji RNaz (RNasecure) in odstranjevalci nečistoč (Chelex100) smo dodatno izboljšali kvaliteto vzorca. Z metodo RT-LAMP smo na tarčni regiji N2 dosegli analitično občutljivost 615 molekul/µL vzorca in analitično specifičnost 97,5 %. Ko smo metodo RT-LAMP preizkusili v realnem okolju s testiranjem vzorcev sline zbranih na COVID vstopni točki, smo dosegli 61 % občutljivost in 89 % specifičnost. Z metodo RT-qPCR smo na istih vzorcih dosegli 95 % občutljivost in 100 % specifičnost. Ugotovili smo, da je slina tudi brez izolacije virusne RNA primerna za detekcijo virusne RNA, vendar je metoda RT-LAMP za ta namen manj uporabna.20212021-09-06 12:40:32Magistrsko delo/naloga129646sl