Sistem za detekcijo homogeno glikoziliranih proteinov na osnovi glikoziltransferaze MGAT-1Kumek, Maks (Avtor) Pavšič, Miha (Mentor) N-acetilglukozaminiltransferaza Ikompozitne mrežeglikan-vezavne sondeSkozi vse domene življenja predstavlja glikozilacija pomemben biološki proces, ki uravnava lastnosti proteinov. Končni produkti procesa glikozilacije so še posebej pomembni za obstoj večceličnih organizmov, saj se vključujejo v procese signalizacije, imunskega odziva, celične adhezije ipd. Čeprav je delo z glikani obetavno za nova odkritja medicine, biokemije, farmakologije in glikobiologije, predstavlja kompleksnost celotnega glikanskega gozda velik izziv v raziskavah. Razvoj primernih metod detekcije glikanov je tako ključen za razumevanje glikoma. Čeprav se pri določanju zaporedji in struktur oligosaharidov najpogosteje uporabljajo destruktivni pristopi (masna spekrometrija, izoelektrično fokusiranje, kapilarna elektroforeza ipd.), se je zadnja desetletja uveljavila tudi uporaba t. i. glikan-vezavnih sond. Pri tej metodi se predvsem uporabljajo lektini in protitelesa, ki vežejo oligosaharide. Obe skupini proteinov imata svoje prednosti in slabosti, ki določajo njuno uporabnost. V diplomski nalogi smo raziskovali možnost pridobitve tretje skupine glikan-vezavnih sond, temelječih na modificiranih glikoziltransferazah. Osredotočili smo se na N-acetilglukozaminiltransferazo I, ključni encim v sintezni poti N-glikanov. Da bi ugotovili smiselnost priprave in vitro sistema za detekcijo homogeno glikoziliranih proteinov na osnovi te glikoziltransferaze, smo se poslužili številnih in silico bioinformatskih pristopov. Tekom dela smo razvili metodologijo za računalniško napoved vezave oligosaharidnih ligandov v glikan-vezavne proteine in s tem pridobili informacije o našem proteinu, do katerih še ni bilo mogoče priti s kristalografskimi pristopi. Dokazali smo, da se nastajajoče glikanske skupine glikoproteinov najverjetneje vežejo v encim, tako da se reducirajoč konec glikanov usmeri proti gibljivi zanki katalitičnega mesta. Uspeli smo pokazati, da smo izbrali smiselne modifikacije izhodiščnega zapisa za humano N-acetilglukozaminiltrasferazo I. S skrajšanjem uporabljenega zapisa smo natančneje napovedali strukturo globularne katalitične domene, z mutacijo katalitičnega ostanka D289 v alanin pa smo vzpostavili številne interakcije z glikanom, ki jih protein tvori šele pri vezavi obeh substratov. Poleg tega smo pridobili izhodišča (v obliki kompozitnih mrež) za nadaljnje modifikacije, ki lahko služijo izboljšavi naših sintetičnih glikan-vezavnih sond v prihodnosti.20212021-09-01 11:40:01Diplomsko delo/naloga129282sl