Razvoj vektorjev mRNA za izražanje molekulskih konstruktov v ciljnih celicahGoljat, Eva (Avtor) Rajčević, Uroš (Mentor) mRNAimunske celicein vitro transkripcijaelektroporacijaGFPCAR-TJurkatRazvoj široko uporabnih gensko spremenjenih imunskih celic je usmerjen v zdravljenje malignih bolezni, med katere spadajo tudi B-celični raki. V ta namen se predvsem limfocite T, ki spadajo med celice, ki jih je težje transformirati, modificira, da izražajo himerni antigenski receptor ali CAR. Ena od metod, ki kaže uspeh pri transformacijah teh celic, je elektrogenski transfer z elektroporacijo, pri čemer do sedaj uporabljene vektorje, kot sta pDNA in retrovirusni vektorji, zamenjuje mRNA, ki je manj toksična. V magistrskem delu smo skušali doseči spreminjanje imunskih celic s prenosom mRNA z elektroporacijo. Najprej smo oba plazmida (s CAR in GFP) pripravili za prepis s PCR in tako linearizirali in pomnožili želen odsek. S komercialnim kompletom smo DNA in vitro prepisali v mRNA in jo v procesu opremili z ustreznimi konstrukti za stabilnost (5'kapa in 3' poli(A) rep) ter jo očistili. Izbrane celice smo elektroporirali z mikroporatorjem Neon Transfection System v kombinaciji dveh različnih pogojev in pri petih različnih količinah mRNA. Ugotovili smo, da je z elektroporacijo mRNA v celicah Jurkat možno izraziti izbrane molekulske konstrukte, vendar nismo dosegli pričakovane ravni uspešnosti izražanja. Sklepamo, da je v splošnem za doseg visoke uspešnosti transformacije in preživetja elektroporiranih celic pred eksperimentom nujna dodatna optimizacija elektroporacije kljub uporabi pogojev, navedenih v literaturi. Potrebno bi bilo optimizirati pripravo in kakovost mRNA vektorjev.[E. Goljat]20212021-08-27 08:52:37Magistrsko delo/naloga129137sl