NMR študija s purini bogatih tandemskih ponovitev povezanih s kolapsom replikacijskih vilicŠadl, Alen (Avtor) Plavec, Janez (Mentor) NMRDNAzaporedje CAGAGGzanke AGAGlasnična zankaV okviru magistrskega dela smo se osredotočili na s purini bogate oligonukleotide DNA, ki vsebujejo nukleotidna zaporedja 5'-d(CAGAGG)-3'. Tandemske ponovitve tega zaporedja pri replikaciji človeške genomske DNA tvorijo slabo raziskane sekundarne strukture, ki se tekom podvajanja ne morejo razviti in posledično pride do kolapsa replikacijskih vilic. Znotraj človeškega genoma najdemo vsaj trikratno ponovitev omenjenega zaporedja v več kot polovici vseh kromosomov. Nekatera najdemo tudi znotraj zapisov za pomembne proteine, kot so nekateri proteini iz družine metalopeptidaz ADAM, transkripcijski faktorji in drugi. Za preučevanje tvorbe sekundarne strukture smo pripravili daljši oligonukleotid RS4, 5'-d(TTGCAGAGGCAGAGGCAGAGGCAA)-3', ki vsebuje trojno ponovitev preiskovanega zaporedja z modificiranim 5'- in 3'-koncem, ki prispeva k večji termodinamski stabilnosti, ter krajši oligonukleotid SLL1 5'-d(GTGCAGAGGCAC)-3', ki vsebuje le eno ponovitev preiskovanega zaporedja. S pomočjo NMR strukturne študije smo ugotovili, da oligonukleotid RS4 tvori strukturo, ki vsebuje steblo in tri zanke AGAG, ki jih v trenutno obstoječi literaturi še nihče ni okarakteriziral na atomskem nivoju. Dokazali smo, da se oligonukleotid RS4 v prisotnosti kalijevih ionov zvije v simetrično strukturo, s po dvema baznima paroma GC in AT v Watson-Crick geometriji. Pri tem velja omeniti, da je simetričnost strukture skladna z NMR spektroskopskimi parametri, zlasti manjšim številom signalov od pričakovanega. Alternativno lahko omenjeno manjše število signalov od pričakovanega pripišemo tudi konformacijskim spremembam s specifično dinamiko, zaradi katere so spektralni signali neopazni na 1H NMR-časovni skali. Pri analizi krajšega oligonukleotida SLL1 smo ugotovili, da ima koncentracija soli nanj večji vpliv, saj višja koncentracija kalijevih ionov favorizira tvorbo dimerne zvrsti SLL1, medtem ko spremembe v molekularnosti zvitja v primeru RS4 nismo ugotovili. S pomočjo 13C- in 15N-izotopskega označevanja posameznih nukleotidnih ostankov v SLL1 in z uporabo 2D NMR-metod smo asignirati večino 1H NMR-signalov. Nadalje smo analizirali korelacije NOE in izračunali strukturni model monomerne zvrsti, s katerim smo pridobili vpogled visoke ločljivosti v strukturne elemente značilne za DNA odseke s tandemskim zaporedjem 5'-d(CAGAGG)-3'.20212021-07-15 14:50:00Magistrsko delo/naloga128502sl