Vpliv kalijevih ionov in vrste oligomera NLRP3 na aktivacijo inflamasomaBoršić, Elvira (Avtor) Hafner Bratkovič, Iva (Mentor) Gunčar, Gregor (Komentor) NLRP3PYDLLPSkalijevi ionitranskripcija/translacija in vitroInflamasom NLRP3 je del naravne imunosti, ki omogoča zaznavo številnih patogenih in endogenih molekulskih vzorcev, ki aktivirajo senzorski protein NLRP3. Njegova oligomerizacija omogoči pripenjanje ASC in pro-kaspaze-1, ki postane aktivna in sproži zorenje vnetnih citokinov IL-1β in IL-18 ter cepitev gasdermina D. N-končni del proteina tvori pore v membrani, skozi katere se v izvencelični prostor sprosti citokin IL1β, ki izzove lokalno vnetje ter celično smrt imenovano piroptoza. Neregulirano delovanje inflamasoma NLRP3 je povezano s številnimi boleznimi, kot sta ateroskleroza in nevrodegenerativne bolezni. Zaenkrat začetne stopnje aktivacije NLRP3 še niso pojasnjene, saj je malo verjetno, da strukturno tako različni aktivatorji neposredno aktivirajo NLRP3. Namen našega dela je bil ovrednotiti začetni del poti aktivacije z osredotočenostjo na oligomerizacijo in pripravo sistemov za preučevanje vpliva K+, kot skupnega dejavnika različnih aktivatorjev, na NLRP3. Ker je nejasno, kakšno strukturo tvori NLRP3 ob aktivaciji, nas je zanimalo, ali lahko inflamasom aktiviramo iz struktur, ki tvorijo brez-membranske organele (LLPS). Na NLRP3PYD smo pripeli proteine, ki fazno separirajo, saj lahko z LLPS lokalno povečamo koncentracijo komponent. Pripravljene variante NLRP3PYD smo stabilno izrazili v makrofagih. Ugotovili smo, da je fuzija s TDP-43 najboljša za aktivacijo inflamasoma, kar smo zaznali kot močno izločanje IL-1β in piroptozo. Opazili smo, da je aktivnost inflamasoma odvisna od kompaktnosti nastalega kondenzata. Z metodo vračanja fluorescence po fotobeljenju smo pokazali, da NLRP3PYD in tudi ASC zamrežita strukturo LLPS, tako da ni več dinamična. Za nadaljnje delo smo pripravili dobra kandidata, ki aktivirata inflamasom, in omogočata preučevanje mehanizma zgornjih poti. V drugem delu smo želeli vzpostaviti sistem za preučevanje oligomerizacije in vitro, saj v celičnem okolju ne moremo enoznačno analizirati neposrednih vplivov na NLRP3. Analizirali smo izražanje NLRP3 z dvema različnima evkariontskima kompletoma za transkripcijo in translacijo in vitro, pri čemer smo zgolj z enim uspešno pripravili proteine, ki so nam omogočili izvedbo fluorescenčne korelacijske spektroskopije. Ugotovili smo, da je slabost takšnih reagentov nizek izplen reakcije. Za preučevanje vpliva K+ na aktivacijo inflamasoma v celicah, smo pripravili funkcionalen NLRP3 s pripetim senzorjem za K+, GINKO1, ki bi lahko omogočal vizualno in kvantitativno spremljanje koncentracij K+. V okviru magistrskega dela smo vzpostavili sisteme, ki nam bodo omogočili nadaljnje raziskovanje vpliva iztoka K+ na oligomerizacijo NLRP3, ter pokazali, da brez-membranski organeli omogočajo robustno aktivacijo inflamasoma.20212021-07-14 09:20:00Magistrsko delo/naloga128459sl