Računalniško podprto načrtovanje in sinteza novih zaviralcev napetostno odvisnih kalijevih kanalov hEAG1 s protitumornim delovanjemToplak, Žan (Avtor) Tomašič, Tihomir (Mentor) Peterlin Mašič, Lucija (Komentor) farmakoforni modelhEAG1hERGionski kanalinhibitorjiKV10.1molekulska dinamikanačrtovanjeprotirakave učinkovineraksintezatarčavirtualno rešetanjeKalijevi kanali se vpletajo v raznolike celične procese s primarno vlogo pri vzdrževanju ionske homeostaze. Ključno vlogo imajo tudi pri patofiziologiji napredovanja rakavih obolenj. Napetostno odvisni kalijev kanal hEAG1 je primer kanala, ki se vpleta v različne procese razvoja raka, saj se njegovo povečano izražanje pojavlja pri večini vrst raka pri človeku. Fiziološko se hEAG1 pojavlja skoraj izključno v centralnem živčnem sistemu in tako predstavlja skoraj popolno novo tarčo za razvoj novih protirakavih učinkovin. Težavo pri razvoju zaviralcev hEAG1 predstavlja kanal hERG, ki spada v isto družino ionskih kanalov kot hEAG1. Posledica zaviranja hERG je lahko podaljšanje srčnega intervala QT. Možnost pojava potencialno smrtno nevarnih aritmij zaradi zaviranja kanala hERG predstavlja velik izziv pri načrtovanju novih zaviralcev hEAG1. V sklopu doktorske disertacije smo začeli z iskanjem novega strukturnega tipa zaviralcev hEAG1. S pristopom na podlagi strukture znanih ligandov smo pripravili farmakoforni model, ki opisuje vezavo analogov naravne spojine purpurealidina I. Ti se vežejo na zunanjo stran napetostnega senzorja hEAG1, ki je odgovoren za prenos spremembe membranske napetosti v spremembo konformacije kanala. Poenostavljen farmakoforni model smo uporabili za virtualno rešetanje, pri katerem smo dobili 18 spojin zadetkov. Izbrane virtualne zadetke smo testirali z metodo vpete krpice membrane ter odkrili spojino z nizkim mikromolarnim zaviralnim delovanjem na hEAG1. Spojina zadetek virtualnega rešetanja, ki je izkazala dobro zaviralno delovanje hEAG1 in vitro, je služila kot osnova za sintezo novih analogov, s katerimi smo želeli izboljšati zaviralno delovanje na hEAG1 in selektivnost napram kanalu hERG. Selektivnost je bila dosežena na številne natrijeve in kalijeve ionske kanale z izjemo kanala hERG. Kljub temu, da nismo uspeli izboljšati selektivnosti na kanal hERG, pa nam je uspelo značilno povečati zaviranje hEAG1. Tako smo ugotovili, da je za zaviralno delovanje najpomembnejša pozitivno nabita aminska skupina, poleg tega pa je potrebno ohraniti tudi nitro in trifluorometilno skupino na aromatskem obroču. Z odstranitvijo hidroksilne skupine smo spojino zadetek pretvorili v nanomolarni zaviralec hEAG1 in tako petkrat povečali zaviralno delovanje v primerjavi z aktivno spojino iz virtualnega rešetanja. Glede na kinetiko vezave spojine zadetka, ki je značilno za spojine, ki se vežejo v osrednjo votlino kanala, smo natančneje preverili potencialno mesto, kamor se novoodkrite spojine vežejo. Pri tem smo uporabili pristope in silico in in vitro, s katerimi smo prišli do skupnega zaključka, da se nove spojine vežejo v še neovrednoteno mesto kanala hEAG1. Metoda in vitro je temeljila na izpodrivanju spojin, ki se vežejo na isto vezavno mesto. Preverili smo, ali spojina zadetek tekmuje s spojinama, katerih vezavno mesto je v osrednji votlini kanala oziroma na zunanji strani napetostnega senzorja (VSD). Nismo zaznali kompeticije niti z astemizolom, ki se veže v poro kanala, niti z mibefradilom, ki se veže v VSD. Na podlagi tega smo se odločili, da z metodo in silico še dodatno preverimo najpogosteje in najbolje raziskano mesto vezave v osrednji votlini. Za ta pristop smo pripravili homologni model hEAG1 v odprti konformaciji in vanj sidrali znane zaviralce hEAG1. Najboljše poze sidranja smo uporabili za simulacije molekulske dinamike. Na podlagi simulacij molekulske dinamike smo pripravili skupen farmakoforni model, ki opisuje vezavo zaviralcev v osrednjo votlino kanala. Ta model ni prepoznal novih zaviralcev hEAG1, kar je v skladu z rezultati in vitro potrdilo, da se kljub značilnemu pozitivno nabitemu centru v zaviralcih le-ti ne vežejo v osrednjo votlino. Velika podobnost tega skupnega farmakofornega modela s farmakofornim modelom za hERG pojasnjuje neselektivnost zaviralcev hEAG1, ki se vežejo v osrednjo votlino. Skupni farmakoforni model predstavlja nove možnosti za odkritje novih strukturnih razredov zaviralcev, ki se ne bodo vezali v osrednjo votlino in bodo izkazovali večjo selektivno delovanje na hEAG1 napram hERG. Antiproliferativno delovanje novih zaviralcev na različnih rakavih celičnih linijah smo preverili z 2D in 3D celičnimi modeli. Celično linijo MCF-7, z visokim izražanjem hEAG1, zavirajo novi zaviralci v mikromolarnem območju. Podobno jakost apoptotičnega delovanja smo opazili tudi na sferoidih celične linije Colo357. Zaradi prisotnosti skupine nitro, ki je nismo uspeli zamenjati z bioizosternimi zamenjavami, smo vrednotili mutagenost spojine zadetka z AMES-ovim testom. Ta ni izkazovala mutagenega delovanja pri necitotoksičnih koncentracijah, a je vseeno potrebna nadaljnja previdnost pri razvoju zaviralcev hEAG1 tega strukturnega razreda. Odkritje novega strukturnega tipa zaviralcev hEAG1 v sklopu doktorske disertacije predstavlja izvirni prispevek k znanosti na področju odkrivanja novih protirakavih učinkovin s tem novim mehanizmom delovanja. V delu smo uporabili inovativne pristope farmakofornega modeliranja v kombinaciji z molekulsko dinamiko za pripravo 3D farmakofornih modelov za odkrivanje in vrednotenje zaviralcev hEAG1. Rezultati doktorske disertacije predstavljajo novo izhodišče za nadaljnji razvoj zaviralcev hEAG1 s protirakavim delovanjem.20212021-07-09 14:51:34Doktorsko delo/naloga128371sl