DNA analiza tobaka (Nicotiana tabacum L.) po transformaciji z Agrobacterium tumefaciensVolarič, Amadeja (Avtor) Luthar, Zlata (Mentor) tobakNicotiana tabacumtransformacijaAgrobacterium tumefaciensDNAtransgenfenotipska analizamolekulska analizaV predhodno pripravljene listne izsečke tobaka (Nicotiana tabacum L.) smo s pomočjo seva LBA4404 bakterije Agrobacterium tumefaciens (A. t.), ki je imela vključen plazmid pART27 2mgfp5 ER ali pCAMBIA1390 DsRed, transformirali dva markerska in dva selekcijska gena. Fenotipsko izražanje obeh markerskih transgenov gfp oz. DsRed smo spremljali v živih celicah tobaka, ki so imele sintetiziran zeleno oz. rdeče fluorescentni protein. Za ločitev transformiranih celic in tkiv od netransformiranih smo uporabili selekcijska transgena nptII in hptII odpornost na antibiotik kanamicin oz. higromicin. Po okužbi izsečkov z A. t. in plazmidom pART27 2mgfp5 ER je bila uspešnost regeneracije 82,65 % in po okužbi z genskim konstruktom A. t. pCAMBIA1390 DsRed 77,89 %. Med vitalne regenerante smo šteli tiste, ki so imeli korenine in pokončne liste. Takih je bilo na gojišču s kanamicinom 63 oz. 77,78 %. Ti so bili tudi pokazatelji uspešnosti transforamcije z nptII transgenom. Po transformaciji izsečkov z A. t. pCAMBIA1390 DsRed je nastalo 51 vitalnih regenerantov. Ti regeneranti so bili sposobni razgrajevati aktivno sestavino higromicina. Uspešnost transformacije je bila 68,92 % za hptII transgen. Pri 4 regenerantih oz. 10 % se niso namnožili fragmenti dolžine 211 bp značilni za DsRed transgen, kljub temu da smo pri njih zasledili prisotnost rdeče fluorescentnega proteina.[A. Volarič]20212021-07-01 07:15:02Diplomsko delo/naloga128009sl