Proteinski inženiring oligomernih oblik katepsina KObaha, Ana (Avtor) Novinec, Marko (Mentor) dimerizacijainterakcijska površinamolekulsko umeščanjeProteinski inženiring vključuje preoblikovanje proteinov z namenom pridobitve proteina, ki bo v primerjavi z nemodificiranim izvirnikom bolj primeren za specifično aplikacijo. Na področju proteinskega inženiringa proteaz so se do sedaj ukvarjali predvsem s spreminjanjem njihove specifičnosti in izboljšanjem encimske aktivnosti, področje proteinskega inženiringa proteaz z namenom oligomerizacije pa je ostalo neraziskano. Namen magistrske naloge je bil identificirati potencialne interakcijske površine monomerne papainu podobne cisteinske peptidaze katepsina K in pripraviti stabilni homodimer. Encim se izraža predvsem v osteoklastih kostnega tkiva, kjer je vključen v proces preoblikovanja kosti. Napake v regulaciji encimske aktivnosti katepsina K so povezane z različnimi bolezenskimi stanji, zaradi česar so struktura, funkcija in aktivnost encima podrobno raziskane. Zato je katepsin K primerna tarča za proteinski inženiring oligomernih encimskih struktur, ki bi bile napram monomerni obliki katepsina K bolj stabilne in aktivne. V prvem koraku raziskovalnega dela smo z uporabo bioinformatskih orodij za napovedovanje interakcijskih površin in molekulsko umeščanje izračunali tri možne načine homodimerizacije katepsina K. Največjo zakopano površino je tvoril dimer, izračunan s programom SymmDock, v katerem nastane interakcija preko izolognih površin, ki vsebujeta ostanke Lys9, Pro15, Gly168 in Ile179. Nastanek in stabilnost izračunanega dimera bi bilo v prihodnosti potrebno eksperimentalno ovrednotiti. V nadaljevanju smo v obliki rekombinantnih encimov izrazili mutanta katepsina K z vstavljenima zaporedjema, ki v katepsinu X tvorita zanki, odgovorni za dimerizacijo in stabilizacijo dimera. Mutantni obliki katepsina K nista bili encimsko aktivni, na podlagi česar smo zaključili, da vstavljeni zaporedji bistveno vplivata na zvitje proteina in/ali interakcije med prodomeno in katalitično domeno ter posledično aktivacijo cimogena. S kromatografijo z ločevanjem po velikosti smo potrdili, da eden od mutantov kljub uvedbi dimerizacijskih zank katepsina X v raztopini obstaja le v monomerni obliki. Drugi mutant, ki vsebuje le eno od dimerizacijskih zank, bi potencialno lahko tvoril dimer, vendar bi bilo njegovo strukturo potrebno podrobneje eksperimentalno ovrednotiti.20212021-05-27 16:15:00Magistrsko delo/naloga127241sl