Dinamični model encima MurD iz E. coli in in silico načrtovanje novih inhibitorjevPerdih, Andrej (Avtor) Šolmajer, Tomaž (Mentor) farmacevtska kemijaprotibakterijske učinkovinebakterijska rezistencatarčebakterijecelična stenapeptidoglikanbiosintezaencimi Murligaze MurMurDencimski inhibitorjiračunalniško podprto načrtovanjemolekularno modeliranjedinamični modeliEscherichia colidisertacijeV zadnjih letih opažamo precejšen porast identificiranih patoloških bakterijskih sevov, ki so odporni na večino znanih protibakterijskih zdravilnih učinkovin. Tako zaskrbljujoče stanje kaže na nujnost pospešenega iskanja novih protibakterijskih učinkovin v vlogi učinkovitega orožja za boj proti patološkim prokariontskim organizmom. Med mnogimi že znanimi in na novo identificiranimi potencialnimi tarčami so encimi, ki sodelujejo v biosintezi bakterijskega peptidoglikana, že dlje časa zanimive tarče zaradi možnosti doseganja selektivne toksičnosti. Sinteza peptidnega dela monomerne enote peptidoglikana poteka intracelularno preko sukcesivnega dodajanja aminokislin na začetni UDP-prekurzor (UDP-MurNAc), ki ga katalizirajo visoko specifični encimi, imenovani Mur sintetaze (MurC, MurD, MurE in MurF). Med njimi encim MurD (UDP-N-acetilmuramil-L-Ala:D-Glu ligaza) katalizira reakcijo tvorbe peptidne vezi med D-glutamatom in uridindifosfatnim (UDP) prekurzorjem UDP-MurNAc-L-Ala (UMA), ki je sočasno sklopljena s hidrolizo energijske molekule ATP od ADP in prostega fosfata Pi.V doktorskem delu smo z metodami molekulskega modeliranja postavili kompleksen dinamični model encima MurD iz bakterijske vrste E. coli, ki povezuje do sedaj znana eksperimentalna spoznanja o tej protibakterijski tarči, in z in silico metodami strukturno podprtega načrtovanja zdravilnih učinkovin identificirali nove inhibitorje Mur ligaz. Z uporabo tarčne molekulske dinamike (TMD) smo, izhajajoč iz objavljenih eksperimentalno določenih odprtih in zaprtih struktur encima, postavili dinamične modele vezave obeh substratov (ATP in UMA) v njuni aktivni mesti in analizirali zapiranje C-terminalne domene MurD. Poleg reproduciranega zaporedja vezave substratov, so TMD simulacije pokazale, da v obratu C-terminalne domene sodeluje več aminokislin. Med njimi še posebej izstopata aminokislinska preostanka Pro300 in Arg302. Simulacije »off-path« tehnike (OPS), ki so razširitev že uveljavljene metode replik (RPATh), smo uporabili za določitev energetike zapiranja C-terminalne domene, ki smo jo dobili s pomočjo TMD simulacij. Rezultati so pokazali, da je prehod iz odprte MurD strukture 1EEH v zaprto 2UAG energijsko bistveno zahtevnejši od prehoda, izhajajočega iz odprte 1E0D strukture. Gibanja Cterminalne domene, ki so omejena na ravnino centralne in N-terminalne domene, so energijsko bistveno manj zahtevna kot gibanje iz te ravnine. S hibridnimi kvantnomehansko/molekulskomehanskimi (QM/MM) metodami smo študirali tri možne mehanizme nastanka tetraedričnega intermediata encima MurD, ki pogosto predstavlja začetno strukturo pri razvoju MurD inhibitorjev. Reakcijske poti med optimiziranimi začetnimi strukturami, konstruiranimi na osnovi dostopnih eksperimentalnih podatkov in tetraedričnimi intermediati smo določili s QM/MM različico metode replik (RPATh). Dobljeni molekularni modeli encimske reakcije so v skladu z ekspermentalnim reakcijskim vrstnim redom in kažejo, da v reakciji najprej reagira substrat UMA z ATP molekulo v acilfosfatni intermediat in da se D-Glutaminska kislina najverjetneje pred reakcijo z acil-fosfatnim intermediatom deprotonira. Simulacije proste energije vezave, izvedene z metodo linearne interakcijske energije (LIE) v seriji Nsulfonilnih derivatov glutaminske kisiline, so reproducirale eksperimentalno določene vrednosti DGvezave. Rezultati simulacij kažejo, da najpomembnejšo vlogo pri vezavi teh inhibitorjev igrajo van der Waalsove interakcije. Energijska analiza prispevkov posameznih delov inhibitorjev (glutaminska kislina, naftalenski del, sulfonamidni del in lipofilni rep) k celotni vezavi je kvantificirala pomen posameznih strukturnih fragmentov, ki sestavljajo ta razred spojin. Izhajajoč iz dostopnih strukturnih podatkov za encima MurD in MurE (oba iz E. coli) smo razvili protokol virtualnega rešetanja (VS), ki je s kombinacijo trodimenzionalnih farmakoforov in molekulskega sidranja služil preiskovanju velikih knjižnic virtualnih molekul. Identificirali smo nov razred dualnih inhibitorjev encimov MurD in MurE, ki kot možen nadomestek za glutaminsko kislino, vsebujejo benzen 1,3- dikarboksilatni fragment. [A. Perdih]20092021-05-14 12:10:42Doktorska disertacija127048sl