Farmakogenetika tiopurin-S-metiltransferazeMilek, Miha (Avtor) Mlinarič-Raščan, Irena (Mentor) farmakogenetikafarmakogenomikatiopurin-S-metiltransferazagenetski polimorfizmi TPMTvlogaSAMFarmakogenetika raziskuje genetske osnove, ki vplivajo na različne odzive posameznikov na zdravljenje. Cilj farmakogenetike je izboljšati učinkovitost in zmanjšati toksičnost terapije pri določenem posamezniku in na ta način omogočiti individualizirano zdravljenje. Tiopurinske učinkovine se uporabljajo pri zdravljenju hematoloških malignosti in avtoimunskih bolezni ter imajo nizek terapevtski indeks, zato se pogosto pojavijo življenjsko nevarni stranski učinki. Za svoje delovanje tiopurini potrebujejo metabolno aktivacijo, količina citotoksičnih in neaktivnih metabolitov pa je odvisna od aktivnosti polimorfnega encima tiopurin-S-metiltransferaze (TPMT). Na podlagi posameznikovega genotipa TPMT lahko prilagajamo odmerek tiopurinskih učinkovin in na ta način preprečimo pojav stranskih učinkov ter izboljšamo potek zdravljenja. V okviru doktorske disertacije smo raziskali povezanost genetskih polimorfizmov in encimske aktivnosti TPMT v slovenski populaciji. Ugotovili smo, da se genotipske frekvence najpogostejših polimorfizmov TPMT*3A (4,1%), TPMT*3C (0,5%) in TPMT*3B (0,3%) ujemajo z vrednostmi pri drugih populacijah Kavkazijcev. Heterozigotni posamezniki z enim mutiranih alelom so imeli nižjo aktivnost TPMT kot posamezniki z divjim tipom alelov. S statistično analizo smo določili mejo med skupinama posameznikov s srednjo in visoko aktivnostjo (9.82 pmol/107 RBC h-1) ter ugotovili, da na podlagi genotipa pravilno napovemo encimsko aktivnost TPMT pri 91,6 % posameznikov. Na ta način smo zasnovali farmakogenetske smernice in vzpostavili analizne metode, primerne za identifikacijo bolnikov s spremenjenim odzivom na tiopurine, pri katerih je potrebno znižanje doze. Zaradi nepopolnega ujemanja genotipa in fenotipa TPMT smo želeli ugotoviti dodatne faktorje, ki vplivajo na aktivnost TPMT in prekomerno toksičnost tiopurinov. V ta namen smo s pomočjo modelne celične linije za akutno limfoblastno levkemijo (ALL) preiskali molekularni mehanizem regulacije aktivnosti TPMT preko metilnega donorja S-adenozilmetionina (SAM). Ugotovili smo, da SAM preko stabilizacije proteinske strukture TPMT prepreči citostatični in citotoksični učinek 6-merkaptopurina (6-MP), zakasni apoptozo, sproženo s 6-MP, ter zniža koncentracijo znotrajceličnih citotoksičnih metabolitov. Potencialni vpliv SAM na toksičnost tiopurinov in pojav stranskih učinkov pri bolnikih z ALL smo ugotovili tudi v retrospektivni študiji, s katero smo dokazali visoko stopnjo povezave med pojavom hematotoksičnosti in prisotnostjo polimorfizmov, ki so povezani z nizko aktivnostjo TPMT in 5,10-metilentetrahidrofolat reduktazo (MTHFR), encimom, ki sodeluje pri biosintezi SAM. Z identifikacijo SAM kot pomembnega modulatorja aktivnosti TPMT in citotoksičnosti 6-MP, lahko pričakujemo upoštevanje novih genetskih in drugih kazalcev pri optimizaciji zdravljenja s tiopurini. V nadaljevanju smo vzpostavili modelne humane celične linije HEK293, HepG2 in Jurkat s stabilnim povečanim izražanjem TPMT za proučevanje endogene funkcije encima. Kot dostavni sistem za vnos plazmida z vključkom zaporedja cDNA za TPMT smo uporabili umetne virusne delce (AVP), ki so omogočili stabilno izražanje fuzijskega rekombinantnega proteina EGFP-TPMT in povečano aktivnost TPMT. Dalje smo ugotovili, da v celicah HEK293 in HepG2 s povečanim izražanjem TPMT poteka hitrejša presnova znotrajceličnega SAM, količina znotrajceličnega S-adenozilhomocisteina (SAH) pa je znižana, medtem ko metilacijski potencial ni spremenjen. Vpliva povečane ekspresije TPMT na celokupno metilacijo DNA v odsotnosti inhibicije DNA-metiltransferaz nismo ugotovili, medtem ko smo v celicah HepG2 odkrili značilno znižane vrednosti reducirane oblike glutationa. Dosedanje raziskave kažejo potencialno endogeno vlogo TPMT pri procesih, ki vplivajo na presnovo SAM, transmetilacijo in oksidativni status celice. Aktivnost TPMT je eden glavnih faktorjev pri presnovi tiopurinskih učinkovin, saj vpliva na učinkovitost zdravljenja in pojav neželenih učinkov. Poleg genetskih polimorfizmov na aktivnost TPMT vpliva tudi količina endogenega metilnega donorja SAM, katerega količina ima potencialen vpliv na pojav prekomerne toksičnosti in odziv posameznikov na tiopurinske učinkovine. Nadaljnje študije bodo razjasnile potencialno endogeno vlogo TPMT pri znotrajcelični presnovi, kar je pomembno za identifikacijo različnih fenotipov, ki nastanejo kot posledica različnih vrednosti aktivnosti encima. [M. Milek]20082021-05-14 11:34:27Doktorska disertacija127046sl