Odkrivanje novih inhibitorjev bakterijskih ligaz z virtualnim rešetanjem in sintezo substratnih analogovKovač, Andreja (Avtor) Gobec, Stanislav (Mentor) Janežič, Dušanka (Član komisije za zagovor) bakterijska rezistencasintezeprotibakaterijske učinkovineinhibitorjivirtualno rešetanjesidranje spojinPojav multi-rezistentnih sevov patogenih bakterij (kot so npr. S. aureus, E. faecium in P. aeruginosa), ki so odporne na več protimikrobnih učinkovin hkrati (MDR = Multidrug resistant bacteria), predstavlja resen problem v sodobnem zdravstvu. Iskanje novih tarč in sinteza protibakterijskih zdravilnih učinkovin z delovanjem na rezistentne bakterije je zato neizogibno v bitki zoper infekcijske bolezni. Ena od pomembnejših tarčnih mest za razvoj novih protibakterijskih učinkovin je še vedno bakterijski peptidoglikan, ki daje bakterijskim celicam obliko in jih varuje pred visokim osmotskim pritiskom. Sestavljen je iz mreže polisaharidnih verig, ki so prečno povezane s kratkimi polipeptidi. Vpletanje v njegovo sintezo ali strukturo vodi do lize celic in posledično do propada bakterij. Biosinteza peptidoglikana je kompleksen proces, ki vključuje okrog 20 reakcij in poteka v citoplazmi, na notranji ter na zunanji strani celične membrane. Pri tem sodelujejo številni encimi, ki predstavljajo potencialna tarčna mesta za razvoj novih protimikrobnih učinkovin. V zadnjem desetletju je vse več raziskav usmerjenih v znotrajcelične citoplazemske faze biosinteze peptidoglikana, med katerimi zavzemajo pomembno mesto Mur ligaze. Gre za štiri od ATP odvisne ligaze (MurC-MurF), ki katalizirajo zaporedno pripenjanje aminokislinskih ostankov na D-laktoilni del peptidoglikanskega prekurzorja UDP-N-acetilmuraminske kisline. Poleg Mur ligaz sodelujejo pri sintezi peptidoglikana še številni drugi pomembni encimi, med njimi tudi D-lanin:Dalanin ligaza (Ddl), ki iz dveh D-alaninov naredi D-Ala-D-Ala dipeptid, ki je substrat za MurF. Peptidoglikan se med rastjo in delitvijo bakterijskih celic stalno obnavlja in preoblikuje, pri čemer poleg omenjenih ligaz sodeluje še murein peptidna ligaza (UDP-Nacetilmuramat: L-alanil-γ-D-glutamil-mezo-diaminopimelat ligaza ali Mpl). Ta encim je sicer neesencialen za preživetje bakterij, vendar zelo pomemben pri recikliranju peptidoglikana, ker lahko v enem koraku pripne tripeptid L-alanil-γ-D-glutamil-mezo-diaminopimelat na UDP-Nacetilmuraminsko kislino.V sklopu raziskav doktorske naloge smo se osredotočili na encime MurC-F, DdlB in Mpl. Medtem ko je o Mpl-u v literaturi le malo podatkov, pa so za ostale encime poleg reakcijskih mehanizmov in specifičnosti, znane še tridimenzionalne strukture apoencimov, oziroma kompleksov encimov s substrati in produkti reakcije, kar nam omogoča racionalno načrtovanje novih zaviralcev Mur ligaz s potencialnim protibakterijskim učinkom. V okviru raziskovalnega dela smo najprej vpeljali v naše laboratorije in vitro test z malahitno zelenim za določanje encimske aktivnosti. Test temelji na osnovi določanja fosfata, ki se sprosti pri encimsko katalizirani reakciji in nam omogoča ovrednotenje inhibitorne aktivnosti potencialnih inhibitorjev Mur ligaz in Ddl. Iskanja inhibitorjev smo se najprej lotili z virtualnim rešetanjem NCI-jeve (National Cancer Institute, Ameriški nacionalni inštitut za raziskovanje raka) banke spojin in z naključnim rešetanjem banke spojin Fakultete za kemijo. Pri virtualnem rešetanju smo uporabili dostopne kristalne strukture encimov MurD (E.coli), MurF (S. pneumonie) in DdlB (E. coli) ter računalniške programe za virtualno rešetanje visoke zmogljivosti eHits 6.0 in AutoDock 4.0, ki nam s svojimi cenilnimi funkcijami omogočijo, da in vitro ovrednotimo le manjšo serijo tistih spojin, ki jim program napove najmočnejšo vezavo. Dobili smo nekaj strukturno povsem novih inhibitorjev DdlB in MurD z IC50 v nizkem mikromolarnem območju. Nekateri so poleg inihibitornega imeli tudi protibakterijsko delovanje. S preučevanjem encimke kinetike smo ugotovili, da je večina DdlB inhibitorjev kompetitivna napram ATP. Nove inhibitorje DdlB diazendikaboksamidnega tipa pa smo odkrili z naključnim rešetanjem domače banke spojin. Z uporabo peptidomimetičnega pristopa in poznavanja reakcijskih mehanizmov, ki pri ligazah MurC-F in DdlB poteka preko tetraedričnega prehodnega stanja smo načrtovali in sintetizirali nove spojine s hidroksimetilkarbonilnim skeletom. Ker murein peptidna ligaza (Mpl) uspešno vgrajuje tripeptid L-Ala-γ-D-Glu-m-A2pm na prekurzor peptidoglikana UDP-N-acetilmuraminsko kislino, smo sintetizirali serijo tripeptidov z osnovnim skeletom L-Ala-γ-D-Glu-Xaa, pri čemer smo na tretjem mestu uporabili različne aminokisline (npr. L-norleucin, L-norvalin, L-diaminobutirno kislino, L-2- aminoheptanojsko kislino, L-alanin, L-glutaminsko kislino). Čeprav encim ni ključen za biosintezo peptidoglikana, bi z vključitvijo lažnih tripeptidov s pomočjo Mpl lahko vplivali na končno sestavo peptidoglikana, ki bi bila zaradi neustrezne zgradbe nestabilna in tako smrtonosna za bakterijo. Dobljeni rezultati so dobro izhodišče za optimizacijo in nadaljnji razvoj, predvsem inhibitorjev encima DdlB. [A. Kovač]20092021-05-14 11:07:52Doktorska disertacija127044sl