Načrtovanje, sinteza in vrednotenje sulfonohidrazidnih inhibitorjev Mur ligazFrlan, Rok (Avtor) Pečar, Slavko (Mentor) Obreza, Aleš (Komentor) bakterijeučinkovineprotibakterijskerezistencasulfonohidradini derivatisintezasintezne spojineinhibitorji Mur ligazZaradi naraščajoče rezistence na protibakterijske učinkovine postajata v današnjem času načrtovanje in sinteza novih protibakterijskih učinkovin vedno bolj aktualna. Med najbolj privlačnimi tarčami so encimi, udeleženi v biosintezi peptidoglikana, ki je ključna sestavina bakterijske celične stene, zato lahko vsaka motnja v tej makromolekuli vodi v propad bakterijske celice. Nekatere od začetnih stopenj v biosintezi peptidoglikana katalizirajo encimi iz skupine Mur ligaz (MurC, MurD, MurE in MurF), ki smo jih izbrali kot tarče pri našem raziskovalnem delu. V okviru doktorske naloge smo ovrednotili hipotezo, da so derivati sulfonohidrazidov lahko potencialni inhibitorji Mur ligaz. Pri tem smo uporabili sodobne pristope farmacevtske kemije, s katerimi smo načrtovali in sintetizirali več strukturno različnih novih sulfonohidrazidnih inhibitorjev Mur ligaz ter jih biokemijsko ovrednotili. V začetnem delu smo se osredotočili zlasti na encim MurC, za katerega ni bilo znanih veliko inhibitorjev, kasneje pa smo načrtovali tudi inhibitorje za ostale Mur ligaze. Eden od pristopov pri načrtovanju novih spojin je bilo posnemanje strukture znanih inhibitorjev MurC, benziliden rodaninov, ki smo jih uporabili kot spojine vodnice. Tiazolidin-2,4-dionski obroč v spojini vodnici smo najprej nadomestili s strukturno sorodnim necikličnim sulfonohidrazonskim skeletom, nato smo preko modifikacij vseh delov molekule poskušali povečati inhibitorno aktivnost na MurC. p-klorobenziltio substituent v spojini vodnici smo tako nadomestili z različnimi arilsulfonati, arilamidi in arilestri. Sintetizirali smo serijo spojin, za katere nam je Urad RS za zaščito intelektualne lastnine za omenjene spojine podelil patent št. SI22254, Evropska patentna organizacija pa je v obravnavo sprejela patent št. EP1845083 (A2). Kljub temu, da je bilo za te spojine sprva ugotovljena inhibitorna aktivnost v mikromolarnem območju, se je kasneje izkazalo, da gre po vsej verjetnosti za t.i.promiskuitetne inhibitorje.Vzporedno smo se lotili racionalnega načrtovanja novih inhibitorjev MurC na osnovi strukture aktivnega mesta encima. Z uporabo programske opreme za virtualno rešetanje in na podlagi objavljene kristalne strukture encima MurC s produktom encimsko katalizirane reakcije smo na osnovi sidranja in povezovanja strukturnih fragmentov v aktivnem mestu načrtovali in sintetizirali spojine s sulfonohidrazidnim skeletom, ki naj bi se vezale v vezavno mesto za difosfatni del substrata (oz. produkta). S kritičnim vrednotenjem rezultatov biokemijskih testiranj smo določili osnovne strukturne zahteve za doseganje dobre inhibitorne aktivnosti na MurC. Prva serija spojin, ki je vsebovala levcinski fragment, je izkazovala inhibitorno aktivnost v srednjem μM koncentracijskem območju in nam je služila kot osnova za nadaljnje delo. Enega prvih sulfonohidrazidnih inhibitorjev MurC (IC50 = 240 μM) smo testirali tudi na bakterijskih kulturah, kjer smo ugotovili šibko protibakterijsko aktivnost (MIC = 128 μg/mL, S. aureus).Sledeče modifikacije so bile usmerjene tako v povečanje topnosti molekul kot tudi v izboljšanje inhibitorne aktivnosti spojin. V ta namen smo levcin zamenjali s treoninom,sulfonohidrazidni fragment pa smo pri nekaterih spojinah nadomestili s hidrazidnim. Uporabili smo različno substituirane aromatske obročne sisteme z namenom povečanja možnosti tvorbe H-vezi med aktivnim mestom encima in polarnimi skupinami na aromatskih obročih. Eden od poskusov doseganja večje inhibitorne aktivnosti je bila tudi rigidizacija spojine, kjer smo namesto levcina uporabili prolin. Kljub dobremu prileganju v aktivno mesto pa nobena od sintetiziranih spojin v tej seriji ni izkazovala inhibitorne aktivnosti. V nadaljevanju smo nato sintetizirali spojine, ki so poleg mimetikov difosfatnega dela substrata (oz. produkta) vsebovale tudi krajše peptidne fragmente, ki so posnemali peptidne dele naravnih substratov encimov MurB, MurC, MurD in Mur E. Z namenom tvorbe močnejših interakcij z aktivnim mestom encimov smo pri nekaterih inhibitorjih namesto karboksilnega dela peptidnih fragmentov uporabili hidroksamske kisline. Kot mimetik difosfatnega dela substrata (oz. produkta) smo v tem primeru uporabili različne mimetike difosfatnega dela substrata (oz. produkta): sulfonamidokarbamatni, sulfonamidotreonin in sulfonamidotreoninohidrazidni mimetik. Spojine smo rigidizirali s fenilnim obročem, katerega smo substituirali s prej omenjenimi mimetiki difosfatnega dela substratov (oz. produktov) in s peptidnimi fragmenti. Na ta način nam je uspelo sintetizirati več serij spojin, od katerih je ena spojina izkazovala inhibitorno aktivnost na MurC v srednjem μM območju. Z opisanimi pristopi nam je uspelo sintetizirati kar nekaj spojin, ki smo jih testirali in vitro na izoliranih bakterijskih encimih. Ob tem smo ugotovili, da so nekatere spojine izkazovale inhibitorno aktivnost v srednjem mikromolarnem koncentracijskem območju.Tekom te doktorske disertacije smo ugotovili, da je sulfonohidrazidni fragment primeren gradnik za načrtovanje inhibitorjev ligaz Mur. Z uporabo pristopov strukturno podprtega načrtovanja smo namreč dosegli, da so se spojine s sulfonohidrazidnim delom v našem modelnem sistemu prilegale v bližino vezavnega mesta za difosfat. eHITS se je pri tem izkazal kot primerno orodje za načrtovanje novih učinkovin, saj nam je omogočil napoved aktivnosti z več kot 50% zanesljivostjo. Z uporabo eHITS in iz rezultatov biokemijskih testov smo spoznali, da se lahko sulfonohidrazidni fragment zamenja s strukturno sorodnim hidrazidnim fragmentom, vendar pri tem tvegamo zmanjšanje topnosti spojin. Prav tako smo ugotovili, da so se kot najbolj optimalne za doseganje inhibitorne aktivnosti izkazale spojine z levcinom v svoji osnovni strukturi. S pomočjo modifikacij v aromatskem delu smo spoznali, da ta del molekule dopušča različne variacije in posledično omogoča izboljševanje inhibitorne aktivnosti tako na MurC kot tudi na MurD. Omenjena spoznanja, dajejo pomemben doprinos k razumevanju odnosa med strukturo in delovanjem pri načrtovanju novih inhibitorjev encimov, udeleženih v biosintezi bakterijske celične stene.[R. Frlan]20092021-05-14 10:57:59Doktorska disertacija127042sl