Identifikacija in ovrednotenje mimotopov glavnega alergena čebeljega strupa Api m 1 za razvoj specifične imunoterapijeZahirović, Abida (Avtor) Lunder, Mojca (Mentor) Korošec, Peter (Komentor) specifična imunoterapijaalergeni čebeljega strupaalergijski odzivmimotop Api m 1alergeni ambrozijeanaliza alergenovAlergija po piku čebele je nevarno bolezensko stanje, saj lahko povzroči hude, v nekaterih primerih ţivljenjsko ogroţajoče anafilaktične reakcije, obenem pa je specifična imunoterapija s čebeljim strupom dolgotrajna, naporna in povzroča neţelene stranske učinke, zato obstaja potreba po novih učinkovinah in alternativnih strategijah zdravljenja. Eno izmed perspektivnejših skupin novih imunoterapevtikov predstavljajo peptidni mimetiki epitopov alergenov (mimotopi). Po principu molekularne mimikrije so mimotopi sposobni sproţiti zelo podoben ali celo enak imunski odziv, kot epitopi, katere posnemajo. Posledično lahko v imunoterapiji predstavljajo nadomestne ligande za alergene. V primerjavi z alergeni je njihova prednost v tem, da, kot kratki peptidi, nimajo vezavnih mest potrebnih za premreţenje IgE na površini efektorskih celic. Zaradi potencialne terapevtske uporabnosti smo v okviru doktorskega dela poiskali mimotope poglavitnega alergena čebeljega strupa, Api m 1. Z rešetanjem bakteriofagnih knjiţnic kratkih naključnih peptidov na tarčnih protitelesih IgG, usmerjenih proti Api m 1, smo odkrili kolekcijo 46 edinstvenih peptidov. V testih vrednotenja je 36 peptidov izkazovalo močno in specifično vezavo do tarčnih protiteles ter kompeticijo z Api m 1 za iste paratope (ali vezišča v neposredni bliţini). Med peptidi smo odkrili dva izrazita aminokislinska motiva GP[S/N/D]ELG[R/K/H] in D[K/R/H]SKP(H). Vpliv prispevka posameznih aminokislinskih ostankov znotraj motiva za vezavo na tarčna protitelesa smo ocenili s testom alaninskega rešetanja. Pri linearnem mimotopu GRMGPSELGPVIG sta se glutaminska kislina in lizin izkazali kot ključni za vezavo, medtem ko alaninske različice cikličnega mimotopa GCWDSLGRAC niso obdrţale vezavnih lastnosti izvornega peptida. Aminokislinska zaporedja pridobljenih peptidov smo in silico prilegali na Api m 1 in določili epitopa, ki gradita površinsko izpostavljeni zanki znotraj regije 17-24 na N-koncu Api m 1 in znotraj regije 119-124 na C-koncu. Za namen aktivne imunizacije smo na podlagi analize rezultatov našega raziskovalnega dela in podatkov iz literature izbrali majhni plaščni protein pIII iz bakteriofaga M13 kot samostojni nosilec mimotopov. Štiri predstavnike identificiranih epitopov smo sintetizirali in jih hkrati pripravili kot fuzijske proteine z nosilcem pIII, tako da smo jih izolirali iz periplazme E. coli. Tako pripravljenim konstruktom in sinteznim peptidom smo ovrednotili njihov imunoterapevtski potencial. Ker smo v procesu selekcije kot tarčna protitelesa uporabili IgG iz zajčjega seruma, smo preverili ali mimotopi ohranijo sposobnost vezave na protitelesa IgE iz seruma pacientov, alergičnih za strup čebele. S testom točkovnega nanosa (ang. dot blot) smo potrdili, da se IgE iz seruma 12 pacientov, reaktivnih na Api m 1, specifično veţejo na štiri izbrane mimotope, spojene z nosilcem pIII, kar potrjuje, da so identificirani epitopi relevantni za oba izotipa protiteles. S pomočjo testa aktivacije bazofilcev (ang. basophil activation test, BAT) smo ugotovili, da mimotopi, spojeni s pIII, ne aktivirajo bazofilcev, torej niso alergogeni. Po stimulaciji s sinteznimi peptidi prav tako nismo zaznali aktivacije bazofilcev, s čimer smo izključili moţnost, da peptidni mimotopi aktivirajo bazofilce preko drugih od IgE neodvisnih mehanizmov. Dodatno smo preverili, ali lahko peptidni mimotopi, z blokado vezavnih mest na IgE, preprečijo degranulacijo bazofilcev, ki jo sproţi alergen Api m 1. Preliminarni rezultati kaţejo, da ni razlik med aktivacijo bazofilcev, ki jo je povzroči Api m 1, in aktivacijo, ki jo je povzročil Api m 1 v prisotnosti mimotopov. Vseeno opisan koncept predstavlja osnovo za nadaljnji razvoj tega novega pristopa k zdravljenju alergij. Vpliv mimotopov na T celični odziv smo ovrednotili z določanjem citokinov v kulturi mononuklearnih celic iz periferne krvi alergičnih pacientov. Čebelji strup in Api m 1 sta spodbudila preteţno citokine Th2, medtem ko je mimotop, spojen s pIII, povečal izločanje interferona gama (IFN-?), kar nakazuje premik citokinskega profila iz Th2 v Th1. Izsledki raziskave tako opredeljujejo mimotope Api m 1 kot obetavne učinkovine za nadaljni razvoj hipoalergenih učinkovin za varnejšo imunoterapijo alergije po piku čebele. V drugem delu doktorske disertacije smo tehnologijo rešetanja bakteriofagnih knjiţnic uporabili za določitev epitopov poglavitnega alergena ambrozije, Amb a 1, pri katerem je dodaten izziv predstavljalo dejstvo, da tridimenzionalna struktura proteina ni znana. Odkrili smo 6 peptidov, ki so specifično vezali tako na tarčna protitelesa IgG, usmerjena proti Amb a 1 kot tudi na IgE iz zmesi serumov alergičnih pacientov. Izselekcionirani peptidi so se le šibko ujemali s primarnim zaporedjem Amb a 1, kar je nakazovalo, da so epitopi konformacijski. Za določitev konformacijskih epitopov smo peptide prilegali na homologni tridimenzionalni model Amb a 1, ki smo ga izdelali v računalniškem programu za molekulsko modeliranje Phyre2. Po prileganju smo z EpiSearch analizo definirali lokacijo moţnih epitopov na površini molekule okoli aminokislinskih ostankov K104, S110, H214 in W312. V zadnjem delu smo se lotili razvoja nove metode za sočasno analizo več alergenov v testu aktivacije bazofilcev (multipleks BAT) s pomočjo fluorescenčnega označevanja alergenov z nanokristali Qdot. Poglavitna alergena čebeljega strupa, Api m 1 in Api m 2, smo konjugirali z nanokristali Qdot dveh različnih velikosti ter primerjalno ovrednotili njihovo primernost za analizo več alergenov hkrati. Uporabili smo nanokristale karboksil-Qdot, pri katerih vezava na alergen poteka preko karboksilne skupine in amino-Qdot, pri katerih vezava poteka preko aminske skupine. Potrdili smo, da označevanje alergenov tako z nanokristali karboksil- kot tudi z amino-(PEG)-Qdot ni vplivalo na njihovo IgE reaktivnost. Nasprotno pa se je alergogena aktivnost oz. sposobnost prekriţanja IgE na površju bazofilcev ohranila le pri alergenih, označenih z nanokristali amino-(PEG)-Qdot. Slednje smo nato uporabili v multipleks testu BAT in rezultat običajne analize BAT primerjali z rezultatom multipleks BAT. Ugotovili smo ujemanje pri 15 od 17 bolnikov in 6 od 6 kontrolnih osebah s primerljivimi krivuljami odziva na alergen, na podlagi česar sklepamo, da so alergeni, označeni z nanokristali amino-(PEG)-Qdot, uporabni za sočasno analizo aktivacije bazofilcev z več alergeni. Multipleks BAT je pomembna nadgradnja trenutnega testa, ki bo pocenil in olajšal diagnostično obravnavo dvojno pozitivnih in polisenzibiliziranih bolnikov, obenem pa odpira nove moţnosti za raziskave, kot je na primer preučevanje razporeditev površinskih IgE na efektorskih celicah.20202021-03-11 11:51:48Doktorsko delo/naloga125335sl