Vpeljava tehnike predstavitve na ribosomih za proučevanje interakcij proteinov z membranamiOmersa, Neža (Avtor) Anderluh, Gregor (Mentor) predstavitev na ribosomihDARPinCDCholesterolna specifičnostpovršinska plazmonska resonancausmerjena evolucijaOd holesterola odvisni citolizini (ang. cholesterol-dependent cytolysins, CDC) imajo pomembno vlogo pri virulentnosti bakterij. Razumevanje njihovega delovanja je pomembno za razvoj učinkovin za zaviranje njihove aktivnosti ter za možnost njihove uporabe v terapevtske, biotehnološke in sinteznobiološke namene. S tehniko predstavitve na ribosomih smo pridobili vezavno proteinsko ogrodje na osnovi racionalno načrtovanega proteina z ankirinskimi ponovitvami (DARPin-a, ang. designed ankyrin repeat protein), ki se je vezalo na Y406A, ki je od pH odvisen mutantni CDC. Izbrani DARPin se je z veliko afiniteto (KD ~ 100 nM) vezal na Y406A na tak način, da je še vedno omogočal vezavo Y406A na membrano, vendar do nastanka pore ni prišlo, hkrati pa je bila vezava DARPin-a na Y406A mogoča, ko je bil slednji že vezan na membrano. Z vpeljavo tehnike predstavitve na ribosomih smo pridobili tudi različice domene CDC za vezavo na membrano (PFOD4), ki so se na membrano vezale z različnimi vezavnimi parametri. Divji tip PFOD4 se je vezal na membrano s 50 molarnimi odstotki holesterola z afiniteto (KD) v nanomolarnem območju. Testirali smo dve različici PFOD4, od katerih se je ena vezala na membranski holesterol manj specifično, in sicer na dve različno dostopni populaciji membranskega holesterola. Obe različici sta imeli KD v enakem območju kot divji tip PFOD4. Na osnovi selektivnega in specifičnega zaviranja aktivnosti CDC z DARPin-om smo postavili proteinska logična vrata na membrani in pokazali princip delovanja takega sistema v sintezni biologiji. Tehnika predstavitve na ribosomih se je izkazala kot primerna tudi za pridobitev različic membranskovezavnih domen CDC s spremenjenimi vezavnimi lastnostmi. V kombinaciji z uveljavljenimi tehnikami za merjenje interakcij predstavlja predstavitev na ribosomih dobrodošlo dodatno orodje za proučevanje interakcij proteinov z membranami, pri čemer so njene glavne prednosti predvsem prilagodljivost, omogočanje številnih kombinacij zamenjav aminokislinskih ostankov ter možnost zorenja afinitete.20202020-10-22 07:15:09Doktorsko delo/naloga121662sl