Uravnavanje izražanja genov z načrtovanimi transkripcijskimi dejavniki, odvisnimi od kalcijevih ionovMeško, Maja (Avtor) Benčina, Mojca (Mentor) jedrni dejavnik aktiviranih celic Tod kalcija odvisna signalizacijatranskripcijskim aktivatorjem podobni efektorjiumetna celična vezjaultrazvokUmetno načrtovani transkripcijski dejavniki so pomembno orodje za specifično uravnavanje tarčnih genov v sintezni biologiji. Privlačen pristop za načrtovanje celičnih orodij za nadzor izražanja genov predstavljajo signalne poti na osnovi Ca2+, saj lahko vdor Ca2+ v celice sprožijo različni dražljaji. V okviru dela smo na osnovi signalne poti Ca2+-kalmodulin-kalcinevrin-NFAT razvili umetne transkripcijske dejavnike. Pri načrtovanju sintetičnih celičnih vezij je zelo pomembno, da z ustreznim načrtovanjem dosežemo nadzor nad aktivnostjo pripravljenih transkripcijskih dejavnikov, za katere želimo, da niso aktivni v odsotnosti stimulacijskega signala. Neželeno konstitutivno aktivnost NFAT v odsotnosti stimulacije smo znižali preko vpliva na lokalizacijo NFAT v celici. Pokazali smo, da z dodatkom signala za transport iz jedra NES ali preko fuzije s sidrnim peptidom KR? zmanjšamo prehajanje NFAT v jedro v odsotnosti stimulacije in tako znižamo neželeno konstitutivno transkripcijsko aktivnost. Večina v literaturi opisanih od Ca2+ odvisnih načrtovanih genskih vezij izkorišča endogeni NFAT, vendar je za optimalno delovanje sintetičnih vezij ključnega pomena, da le-ta delujejo neodvisno od endogenih procesov gostiteljske celice. Naš cilj je bil pripraviti umetne transkripcijske dejavnike, ki omogočajo ciljanje poljubnih tarčnih genov in hkrati ne vplivajo na izražanje endogenih genov v gostiteljski celici. Pripravili smo umetne transkripcijske dejavnike na osnovi regulatorne domene humanega ali mišjega NFAT in načrtovane DNA-vezavne domene efektorjev TAL ter potrdili, da aktivirajo transkripcijo poročevalskih genov v odvisnosti od znotrajcelične koncentracije Ca2+ v več vrstah sesalskih celic. Pomembna lastnost načrtovanih celičnih orodij je njihov odziv na fizikalno-kemijske signale, kar omogoča zunanji nadzor celičnih procesov. Ultrazvok omogoča natančno fokusiranje signala in je bil že uporabljen za stimulacijo mehansko občutljivih ionskih kanalov. V okviru dela smo razvili metodo za stimulacijo sesalskih celic z ultrazvokom in pokazali, da lahko z ultrazvokom aktiviramo pripravljene transkripcijske dejavnike v sesalskih celičnih linijah in poskusnih živalih, v katere smo vnesli predhodno pripravljene celice. Razvita metoda stimulacije sesalskih celic z ultrazvokom zaradi neinvazivnosti in sposobnosti prodiranja globoko v tkiva predstavlja inovativen način stimulacije s potencialom za terapevtsko uporabo.20202020-10-15 07:15:08Doktorsko delo/naloga121540sl