Vpliv devterirane vode na vezavne in funkcionalne lastnosti astrocitnega histaminskega receptorja H [spodaj] 2Zorc, Anže (Avtor) Kržan, Mojca (Mentor) Mavri, Janez (Komentor) histamin histaminski receptor H2 vodikova vez devterirana voda cAMPHistamin je pomemben endogeni mediator, prisoten v večini človeških tkiv in organov. V osrednjem živčevju ima vlogo živčnega prenašalca, medtem ko v ostalih delih telesa deluje kot lokalni hormon. Svoje učinke posreduje preko 4 podtipov histaminskih receptorjev: H1, H2, H3 in H4. Vsi spadajo v veliko skupino metabotrobnih receptorjev, ki za svoje delovanje in prenos informacije potrebujejo sklopitev z membranskim proteinom G (GPCRs). Histaminski receptor H2 ima poznano primarno strukturo in vsebuje 7 hidrofobnih transmembranskih področij. Primarno vezavno mesto za histamin se nahaja v žepu znotraj lipidnega dvosloja in vključuje aminokislinske ostanke iz področij 3 in 5. Ključno vlogo pri vezavi naj bi imela ionska vez med Asp98 tretjega transmembranskega področja in dušikovim atomom stranske verige histamina, ter vodikove vezi Asp186 in Thr190 petega transmembranskega področja z dušikovimi atomi imidazolnega obroča histamina.V naši raziskavi smo se osredotočili na vpliv vodikovih vezi na vezavne in funkcionalne lastnosti histaminskega receptorja H2. Z zamenjavo kontrolnega okolja (H2O) z devteriranim okoljem (D2O), zaradi nuklearnih kvantnih efektov povzročimo spremembe medmolekulskih in znotrajmolekulskih razdalj, saj se izmenljivi atomi vodika, tj. taki, ki disociirajo, zamenjajo z dvakrat težjimi atomi devterija. To vodi do strukturnih sprememb ligandov in vezavnega mesta na receptorju, ki se odrazijo v spremenjenih vezavnih in funkcionalnih lastnostih receptorja. V diplomskem delu smo opredelili vezavna receptorska mesta na histaminskem receptorju H2 na astrocitih neonatalnih podgan, vzgojenih v primarni kulturi, pokazali ključno vlogo vodikove vezi pri interakciji ligandov na ta podtip receptorja in preverili, kako se strukturne spremembe ligandov in receptorja odrazijo v vezavnih (maksimalna gostota vezavnih mest, afinteta vezave) in funkcionalnih (s histaminom izzvana produkcija cAMP) lastnostih receptorja. Uporabili smo metode vezavnih študij, kjer smo z uporabo radioliganda 3H-tiotidina dokazali prisotnost histaminskih receptorjev H2 na astrocitih neonatalnih podgan, vzgojenih v primarni kulturi, z maksimalno gostoto vezavnih mest 21,95  3,2 fmol/mg proteinov in ravnotežno disociacijsko konstanto 6,3  1,9 nM. V devteriranem okolju je maksimalna gostota vezavnih mest za 3H-tiotidin znašala 17,42  5,2 fmol/mg proteina, ravnotežna disociacijska konstanta pa 8,63 ± 5,0 nM, vendar razliki nista statistično značilni. V inhibicijski študiji smo potrdili, da se afiniteta cimetidina (antagonista) do vezavnih mest histaminskega receptorja H2 ni bistveno spremenila. V kontrolnem okolju s H2O je pIC50 znašala 7,7 ± 0,49, medtem ko je v devteriranem okolju znašala 7,6 ± 0,21. V funkcijski študiji smo z merjenjem koncentracije znotrajceličnega cAMP potrdili zmanjšanje s histaminom izzvane produkcije cAMP v devteriranem okolju. Ugotovili smo tudi, da je za padec v produkciji cAMP v devteriranem okolju v pretežni meri odgovorna zmanjšana afiniteta agonista (histamina) do vezavnega mesta na histaminskem receptorju H2, saj se afiniteta antagonista do vezavnega mesta (cimetidina) ni bistveno spremenila. Sklenemo lahko, da vodikova vez igra pomembno vlogo pri vezavi ligandov na histaminski receptor H2 na astrocitih neonatalnih podgan. Devterirano okolje vpliva na vezavo ligandov na histaminski receptor H2, saj povzroči spremembo razdalj in jakosti vodikovih vezi, te spremembe pa so bolj izrazite pri vezavi agonistov, kot pri vezavi antagonistov. Spremenjene vezavne lastnosti histamina se odrazijo v padcu s histaminom izzvane produkcije cAMP.[A. Zorc]20132020-09-30 09:52:01Diplomsko delo121139sl