Vrednotenje različnih načinov dostave antigenskega peptida Wilmsovega tumorja 1 v dendritične celice pripravljene iz popkovnične krviZag, Ági (Avtor) Jeras, Matjaž (Mentor) de Haara, Colin (Komentor) dendritične celice celično cepivo Wilmsov tumor 1 akutna mieloblastna levkemija verižna reakcija s polimerazoRaziskovalna skupina oddelka za imunologijo Univerzitetnega medicinskega centra v Utrechtu, na Nizozemskemu, je razvila predklinično cepivo na osnovi človeških dendritičnih celic (DC), pridobljenih iz CD34+ krvotvornih matičnih celic (KMC) izoliranih iz popkovnične krvi. Cepivo bodo uporabili v klinični študiji, v katero bodo vključili pediatrične bolnike z akutno mieloblastno levkemijo (AML), in sicer po kemoterapiji in presaditvi KMC iz popkovnične krvi. Glavna tarča imunske terapije bo znani onkoprotein Wilmsovega tumorja 1 (WT1), ki je prisoten pri več kot 90% pediatričnih bolnikov z AML. DC, ki jih opremimo z antigenom WT1 bodisi v obliki mRNA za celotno dolžino proteina ali z definiranimi peptidi, ki jih učinkovito vežejo in predstavljajo ustrezni aleli molekul HLA razreda I, izzovejo specifičen citotoksični T celični imunski odziv in posledično ubijanje preostalih levkemičnih blastov po presaditvi KMC. Izkoreninjenje vseh tumorskih celic je ključnega pomena za preprečitev ponovnega izbruha bolezni, ki je poglavitni vzrok visoke smrtnosti bolnikov z AML. Cilj našega dela je bil določiti optimalen način opremljanja DC s specifičnimi antigeni onkoproteina WT1 za uspešno indukcijo protitumorskih klonov CD4+ in CD8+ limfocitov T. S tem smo želeli ojačati antigenski potencial celičnega cepiva za vzpostavitev dolgoročnega protitumorskega celičnega spomina. Poleg tega smo z uporabo človeških levkemičnih celičnih linij optimizirali 4-urni citotoksični test s CD4+ in CD8+ limfociti T, opremljenimi z rekombinantnimi T-celičnimi receptorji (TCR), specifičnimi za antigenski peptidni epitop (aminokislinsko zaporedje 126-134) WT1, vezan na molekulo HLA-A2, pri čemer smo tarčne celice označili s fluorescenčnim barvilom CellTrace Violet (CTV). Kot tarčne celice smo uporabili tumorske celice, ki izražajo molekule HLA-A2 in jih bodisi transficirali z mRNA z zapisom celotne dolžine proteina WT1 ali pa jih opremili s sintetiziranimi peptidi, sestavljenimi iz po 15 aminokislinskih ostankov, za katere smo v predhodnih raziskavah dokazali, da imajo največjo sposobnost aktivacije citotoksičnih limfocitov T. Izvajali smo tudi 24-urne T-celične aktivacijske teste in teste ELISA, s katerima smo potrjevali omenjene ugotovitve. Določili smo štiri konstrukte zapisov DNA za naraščajoča aminokislinska zaporedja proteina WT1, pri čemer smo za osnovo vzeli dobro raziskani peptidni epitop RMFPNAPYL (aminokislinski ostanki 126-134) WT1, ki se veže na molekule HLA-A2. Uspešno smo izbrali začetne oligonukleotide za njihovo pomnoževanje z metodo PCR in tako pridobili želene fragmente DNA. Te smo nato vstavili v plazmidni vektor pcDNA 3.1 in jih klonirali v bakterijah Escherichia coli. Kljub večkratnim poskusom pa nam iz bakterijskih kolonij žal ni uspelo izolirati ustreznih klonov plazmidne DNA.[Á. Zag]20172020-09-28 10:55:51Magistrsko delo/naloga120965sl