Ugotavljanje konformacijskih sprememb monoklonskih protiteles in razvoj modela za napovedovanje njihove stabilnostiMarkoja, Uroš (Avtor) Kristl, Julijana (Mentor) Winter, Gerhard (Komentor) Svilenov, Hristo (Komentor) monoclonal antibody therapeutic proteins protein stability chemical denaturation fluorescence spectroscopy kinetic simulationMonoklonska protitelesa (mAb) uporabljena kot biološka zdravila, so skupina bioloških zdravil, katerih pomembnost v zadnjih treh desetletjih strmo narašča. Večina zdravil z mAb na trgu se nahaja v obliki tekočih formulacij v katerih pa mAb razpadajo po poteh, ki jih je težko predvideti. Za določitev konformacijske stabilnosti proteinov v raztopinah predstavlja kemična denaturacija alternativen pristop termičnemu stresu. Namen magistrske naloge je bil proučiti konformacijske spremembe modelnega IgG1 monoklonskega protitelesa v prisotnosti kemičnih denaturantov z uporabo različnih eksprerimentalnih in teoretičnih pristopov. Poleg tega smo želeli izboljšati v literaturi že znano metodo testiranja stabilnosti z Ab tako, da bi lahko hitreje in enostavneje zaznali razlike v njihovi strukturi. Proučevali smo stabilnost modelnega mAb pod vplivom najpogostoje uporabljenih denaturantov (gvanidinijevega hidroklorida (GuHCl) in sečnine) in treh alternativnih denaturantov (gvanidinijevega tiocianata, N-metil sečnine in N-etil sečnine), in sicer tako eksperimentalno kot matematično. Merili smo spremembo intenzitete intrinzične fluorescence kot posledico razvijanja mAb pri pH 4,5 do 8,5 v 24 urah in 15 dneh pri 24 različnih koncentracijah denaturanta. Iz denaturacijskih krivulj (odvisnost signala intrinzične fluorescence od koncentracije denaturanta in časa) smo izračunali ΔG in polovične čase t1/2 razvitja z uporabo eksperimentalnega in matematičnega modeliranja. Za evaluacijo napovednih metod stabilnosti smo izvedli pospešene stabilnostne teste pri 40°C v 12-ih tednih. Izmed preučevanih denaturantov povzroča le GuHCl zadovoljivo razvijanje mAb in je lahko uporabljen kot denaturant na celotnem spektru testiranih puferskih raztopin. Pri merjenju kinetike razvitja v prvih 24 urah smo dokazali, da polovični časi t1/2 korelirajo s spremembami proste energije ΔG iz denaturacijskih krivulj s Pearsonovim korelacijskim koeficientom 0,78. Za razvrstitev pufernih raztopin z mAb po stabilnosti, osnovano na t1/2, potrebujemo trikrat manj proteina v primerjavi z uveljavljenim termičnim pristopom, kjer je izračunan ΔG in daje vrednosti z manjšo standardno deviacijo. Razviti pristop z določitvijo t1/2 bi lahko nadomestil standardne izračune ΔG. Pri spremljanju kemične denaturacije v 15-ih dneh smo opazili spremembe signala intrinzične fluorescence v tranzicijski regiji denaturacijske krivulje. Meritve z dinamičnim sipanjem svetlobe so pokazale, da je to najverjeneje posledica aggregacije. S prileganjem signala intrinzične fluorescence s pseudo prvim redom kinetike aggregacije smo pridobili aggregacijske čase tagg. Opazovali smo tudi majhne premike signala intrinzične fluorescence v pred-tranzicijski regiji pri ~1M koncentraciji GuHCl po inkubaciji do 15 dni. Ti premiki so zelo dobro korelirali (Pearsonovov korelacijski koeficient 0,89) s kinetičnimi konstantami razpada monomera pri pospešenih stabilnostnih študijah pri 40 °C v 12 tednih. Merjenje majhnih premikov intrinzične fluorescence mAb v pred-tranzicijski regiji bi tako lahko bilo novo orodje za napoved izzida pospešenih stabilnostnih testov.[U. Markoja]20172020-09-21 08:55:34Magistrsko delo/naloga120504sl