Izražanje in vrednotenje encimske aktivnosti rekombinantne človeške indolamin 2,3-dioksigenaze 1 ter sinteza izoksazolo[5,4-d]pirimidin-4(5H)-onskih zaviralcevAbe, Aljaž (Avtor) Sova, Matej (Mentor) Bratkovič, Tomaž (Komentor) indolamin 23-dioksigenaza 1zaviralciekspresijaEscherichia coliimunoterapija rakaIndolamin 2,3-dioksigenaza 1 (IDO1) je poglavitni encim kinureninske metabolne poti, kjer katalizira pretvorbo L-triptofana v N-formilkinurenin. Za večino vrst rakavih obolenj je značilno povišano izražanje encima, kar je v tesni povezavi s slabo prognozo in nižjo možnostjo preživetja. IDO1 je vpleten v zaviranje efektorske funkcije celic T in ubijalk, diferenciacijo in aktivacijo imunosupresivnih regulatornih limfocitov T ter celic mieloidne supresorske vrste, kar promovira razrast tumorskih celic, omogoča neovaskularizacijo in zmanjšuje učinkovitost imunoterapij. Rezultati prvih in drugih faz kliničnih vrednotenj zaviralcev IDO1 so obetali protitumorno delovanje, a zaenkrat še nimamo potencialne učinkovine, ki bi prestala vse klinične faze. V sklopu magistrske naloge smo želeli z uporabo ekspresijskega sistema Escherichia coli pridobiti IDO1, ki bi izkazoval ekvivalentno aktivnost v primerjavi s komercialno dostopnim encimom in sintetizirati nove zaviralce IDO1 ter ovrednotiti njihovo zaviralno aktivnost. Z optimizacijo sestave gojišča in pogojev gojenja smo skušali zagotoviti čim večje izražanje. Celicam smo dodali različne prekurzorje za sintezo hema in primerjali izkoristek gojenja po 24 h in 48 h v prisotnosti oz. odsotnosti induktorja. S poliakrilamidno gelsko elektroforezo v prisotnosti natrijevega dodecilsulfata smo potrdili istovetnost produkta in pretežno zastopanost v topni obliki, nakar smo protein izolirali in očistili s kovinsko-kelatno afinitetno kromatografijo in gelsko filtracijo. Koncentracijo očiščenega encima smo določili spektrofotometrično pri 280 nm, še bolj pa nas je zanimala vrednost razmerja absorbanc A404/A280, ki korelira z deležem proteina, na katerega je vezan hem, kar vpliva na encimsko aktivnost. Največ rekombinantnega encima smo uspeli pridobiti, če smo bakterijam v gojišče dodali 5-aminolevulinsko kislino in z gojenjem nadaljevali še 24 h po indukciji izražanja. Aktivnost rekombinantnega encima IDO1 je bila kar petkrat nižja od komercialnega, verjetno na račun odsotnosti reducenta po zadnjem kromatografskem čiščenju. Sintetizirali smo tri končne spojine na osnovi 2-(3-(4-fluorofenil)-4-oksoizoksazolo[5,4-d]pirimidin-7(4H)-il)-N-fenilacetamidnega skeleta, ki so se razlikovale v substituentu na položaju meta fenilnega obroča, vezanega na N-atomu acetamida. Zaviralno delovanje končnih spojin smo vrednotili s fluorescenčnim testom, pri katerem se je kot najmočnejši zaviralec z IC50 vrednostjo 55.1 µM izkazala spojina 10 s trifluorometilno skupino. Čeprav rekombinantni encim ni dosegel želene aktivnosti, pa smo z našim raziskovalnim delom pomembno prispevali k temu, da bo v prihodnje možno pridobiti kristalno strukturo in na osnovi lastnosti vezavnega mesta načrtovati še močnejše zaviralce.20202020-09-18 08:45:16Magistrsko delo/naloga120346sl