Implementacija tehnologije CRISPR/Cas v razvoj celičnih linij CHOPavlič, Urša (Avtor) Štrukelj, Borut (Mentor) Vogelsang, Matjaž (Komentor) celična linija CHO tehnologija CRISPR/Cas puromicin produktivnost celic tarčno izbijanje genovBiološka zdravila so spremenila način in uspešnost zdravljenja mnogih bolezni zaradi njihovega tarčno specifičnega delovanja. Za pravilno zvitje proteina in ustrezne posttranslacijske spremembe je pomembna premišljena izbira ekspresijskega sistema, v katerem bo potekala proizvodnja želenega rekombinantnega proteina. Na tem področju je v ospredju (poleg prokariontskih celic bakterije Escherichia coli, ki se uporabljajo za bioprodukcijo enostavnejših neglikoziliranih proteinov) uporaba sesalskih celičnih linij, kjer prevladujejo ovarijske celice kitajskega hrčka (celice CHO). Slednje imajo sicer vse potrebne karakteristike za proizvajanje biološko aktivne oblike proteina, a v zadnjem času raste želja po izboljšanju celičnih linij za dosego višjih titrov in boljše kvalitete produkta. Tu nastopijo različne metode za urejanje genoma, ki temeljijo na prelomih dvojne vijačnice in s tem povzročijo želene genetske spremembe. Trenutno je najbolj atraktivna tehnologija CRISPR/Cas9 (skupki regularno porazdeljenih kratkih palindromskih ponovitev in z njimi povezani protein 9), s pomočjo katere številni avtorji poskušajo izbiti določene gene ali pa povečati njihovo izražanje. V okviru magistrske naloge smo zato poskusili implementirati tehnologijo CRISPR/Cas9 v razvoj celičnih linij CHO z namenom, da bi potencialno lahko ustvarili visoko producirajoče celične linije. Za modelne gene smo izbrali PlekhB1, Rps6KA2, Sept1, Flt1 in Fkbp10, kateri naj bi imeli vpliv na nižjo produktivnost celic. Najprej smo na podlagi rastne krivulje za uporabljeno celično linijo CHO-der3 določili mejo celične gostote za precepljanje celic (6,0 x 106 viabilnih celic/ml) in razmerje precepljene kulture (1/12) ter s tem omogočili ohranjanje celic v eksponentni fazi rasti. Za ločevanje transficiranih od netransficiranih celic in učinkovito delovanje sistema CRISPR/Cas9, smo določili optimalne selekcijske pogoje (5 μg/ml puromicina, 5 dni) in dosegli 50 – 60 % uspešnost pri izbijanju gena PlekhB1 ob uporabi vektorja kot dostavnega sistema. Ugotovili smo, da je sistem CRISPR/Cas9 deloval izven tarčno z enako učinkovitostjo kot na tarčnem mestu gena PlekhB1. Ob sočasni dostavi 8 različnih sgRNA za gene PlekhB1, Rps6KA2, Sept1 in Flt1 (2 sgRNA za vsak gen) smo dosegli 10 – 20 % uspešnost izbitja posameznega gena. Pri dostavi sgRNA v obliki PCR-pomnožkov ali v obliki vektorjev ni bilo razlik v učinkovitosti. Na koncu smo z dostavo sgRNA v obliki vektorjev izbili gene PlekhB1, Rps6KA2, Sept1, Flt1 in Fkbp10 z visoko (50 – 94 %) Implementacija tehnologije CRISPR/Cas v razvoj celičnih linij CHO učinkovitostjo. Ob primerjavi titrov kontrolnih klonov in klonov z izbitim genom nismo zaznali statistično značilne razlike med skupinama. Zaključimo lahko, da smo tehnologijo CRISPR/Cas9 uspešno implementirali v razvoj celičnih linij CHO za tarčno izbijanje posamičnih genov in pokazali, da geni PlekhB1, Rps6KA2, Sept1, Flt1 in Fkbp10 nimajo vpliva na produktivnost celic.[U. Pavlič]20182020-09-17 12:06:59Magistrsko delo/naloga120271sl