Vloga mikro RNA 204 pri uravnavanju izražanja genov za osteonektin in kostni morfogeni protein 1 v osteosarkomskih celičnih linijahHadžidaova, Petra (Avtor) Marc, Janja (Mentor) Lovšin, Nika (Komentor) miR-204-5p SPARC kostni morfogeni protein BMP1 luciferaza verižna reakcija s polimerazoPri osteoporozi pride do nastanka osteoporotičnih zlomov, ki so pomemben vzrok bolečin, invalidnosti in smrti, zato je njeno odkrivanje in zdravljenje zelo pomembno. Številne študije so preučile in potrdile vpliv mikro RNA (miRNA) na uravnavanje kostne remodelacije in s tem odkrile nove potencialne tarče za njeno odkrivanje in zdravljenje. Namen naloge je bil preveriti, ali se miR-204-5p veže na mRNA tarčnih genov SPARC in BMPR1A, ali na vezavo miR-204-5p vpliva različna stopnja diferenciacije osteoblastov, ter v nadaljevanju ugotoviti ali miR-204-5p vpliva na izražanje genov SPARC in BMP1. S tehnologijami rekombinantne DNA smo pripravili plazmidne konstrukte pmirGLO, ki so vključevali tarčna (vezavna) zaporedja znotraj 3' regije mRNA genov SPARC in BMPR1A, in nato z dvojnim luciferaznim testom preverili njihovo aktivnost v humanih osteosarkomskih celičnih linijah HOS, MG-63 in saos-2. Preko uporabe različnih osteosarkomskih celic, ki se razlikujejo v stopnji diferenciacije osteoblastov, smo preverili vpliv le-te na vezavo miR-204-5p. Na konec 3' regije gena za kresničkino luciferazo smo klonirali fragmente genov, ki so vsebovali nemutirano in mutirano vezavno mesto za miR-204-5p, in izmerili aktivnost kresničkine (luc) ter renilne luciferaze (Rluc), ki je tudi sestavni del plazmida pmirGLO in izračunali relativne luciferazne aktivnosti (luc/Rluc). Na celicah HOS smo eksperimente izvedli tudi z dodatkom sintetičnih molekul miRNA, hsa-miR-204-5p. P-vrednosti znotraj vseh celičnih linij za vse primerjane plazmide niso bile statistično značilne. Na vezavna mesta, izbrana s pomočjo biostatističnih orodij, se torej miR-204-5p ni vezala, prav tako na to vezavo ne vpliva stopnja diferenciacije osteoblastov, saj ni bilo razlik v luciferazni aktivnosti med različnimi celicami. V drugem delu naloge smo v celicah HOS preverili vpliv mimikov hsa-miR-204-5p na izražanje genov SPARC in BMP1 z verižno reakcijo s polimerazo v realnem času ob uporabi nespecifičnega barvila EvaGreen®. Rezultate smo obdelali s t-testom za neodvisne vzorce in ugotovili, da miR-204-5p ne vpliva na izražanje genov SPARC in BMP1. Z laboratorijskimi eksperimenti nismo potrdili biostatistično izbranih tarč SPARC in BMPR1A kot direktnih tarč za miR-204-5p v osteosarkomskih celičnih linijah. Prav tako nismo dokazali vpliva stopnje diferenciacije osteoblastov na vezavo miR-204-5p in nismo dokazali vpliva miR-204-5p na izražanje genov SPARC in BMP1 v celicah HOS.[P. Hadžidaova]20182020-09-16 14:18:04Magistrsko delo/naloga120171sl