Postavitev in optimizacija neradioaktivnega imunosupresivnega delovanja mezenhimskih matičnih celic in vitroGrabnar, Bojana (Avtor) Jeras, Matjaž (Mentor) mezenhimske matične celice akutna bolezen presadka mitogenska aktivacija limfocitov T alogenska aktivacija limfocitov T inhibicija T-celične proliferacije proliferacijski funkcijski testiČloveške mezenhimske matične celice (MMC) so sposobne diferenciacije v številne vrste somatskih celic, še zlasti tistih, ki so v vezivnem tkivu. V organizmu se nahajajo v različnih tkivih. Povečano zanimanje za njihovo klinično uporabo so spodbudila tudi spoznanja, da lahko vplivajo na imunske odzive v telesu, pri čemer je posebej pomembno njihovo zaviralno delovanje na aktivacijo limfocitov T. To pomeni, da bi z njihovo uporabo lahko preprečili nastanek akutne bolezni presadka zoper gostitelja (aGvHD) po presaditvi alogenskih KMC oz. jo na ta način zdravili. V okviru magistrske naloge smo si za cilj postavili vzpostavitev in optimizacijo neradioaktivnih proliferacijskih funkcijskih testov in vitro, ki bi nam omogočali zanesljivo določanje imunosupresivnega delovanja MMC. Najprej smo preskušali različne parametre gojenja in stimulacije mononuklearnih celic iz periferne krvi (MNC) in vitro, da bi ugotovili optimalen postopek neradioaktivnega določanja obsega T-celične proliferacije. Ugotovili smo, da je za izvedbo testa najprimernejša uporaba mikrotitrskih plošč s 96 vdolbinicami s polkrožnim dnom, brezserumskega medija BioTargetTM-1 ter 72-urna inkubacija MNC po njihovi aktivaciji z mitogenskim lektinom fitohemaglutininom (PHA) oziroma 6 dni po njihovi izpostavitvi aloantigenom v enosmernih in/ali dvosmernih mešanih limfocitnih kulturah (MLC). Obseg celične proliferacije smo vrednotili z merjenjem absorbanc po uporabi reagentov MTS (490 nm) ali CCK-8 (450 nm) in dodatni inkubaciji. Glede na rezultate smo kot najprimernejša testna modela izbrali mitogensko stimulacijo MNC s PHA in dvosmerno kulturo pomešanih MNC dveh nesorodnih oseb, ob uporabi reagenta MTS. V nadaljevanju smo ju nato uporabili za določitev obsega inhibicije T-celične proliferacije v prisotnosti različnih količin alogenskih MMC iz kostnega mozga. V primeru s PHA izzvane aktivacije, je bilo imunosupresivno delovanje MMC najmočnejše pri razmerju MNC : MMC = 8 : 1, v dvosmernih MLC pa pri razmerju MNC : MMC = 4 : 1. To razliko lahko pojasnimo z dejstvom, da alogenska stimulacija aktivira le omejeno število klonov limfocitov T, medtem ko mitogenska stimulacija s PHA izzove popoln proliferacijski odziv omenjenih celic.[B. Grabnar]20182020-09-16 14:11:40Magistrsko delo/naloga120170sl