Izbitje genske gruče SNORD116 iz Prader-Willi lokusa v sesalskih celičnih linijahKnez, Lea (Avtor) Rogelj, Boris (Mentor) Prader-Willijev sindromSNORD116scCRISPRNTERA-2/D1SH-SY5YPrader-Willijev sindrom (PWS) je kompleksna multisistemska genetska bolezen, ki povzroča nevrološke, metabolne, endokrine in vedenjske motnje. Bolezen je posledica pomanjkanja izražanja očetovsko podedovanih genov na 15q11.2-q13 genomski regiji. Številne študije z mikrodelecijami so zožile kritično regijo PWS na gručo genov SNORD116, ki predstavlja glavno genetsko determinanto bolezni. Gensko gručo SNORD116 sestavlja 29 homologov, ki spadajo v družino malih nukleolarnih RNA s C/D ohranjenim motivom. Sekvenca SNORD116 ni komplementarna nobeni od kanoničnih RNA-tarč, zato ostaja biološka funkcija teh nekodirajočih RNA še neznana. Ravno iz tega razloga je ena izmed najpomembnejših nalog raziskav na tem področju iskanje in ovrednotenje nekanoničnih RNA-tarč iz družine SNORD116, ki bi bistveno pripomogle k določitvi vloge genske gruče pri patofiziologiji bolezni. V diplomskem delu smo s tehnologijo scCRISPR poskušali ustvariti celični liniji NTERA2/D1 in SH-SY5Y z izbitima genskima gručama SNORD116. Celična modela bi služila kot osnova za nadaljnje raziskovanje in validiranje najbolj verjetnih potencialnih tarč družine SNORD116. S pomočjo spletnih orodij smo na lokusu PWS izbrali tarčna zaporedja in načrtali sgRNA, ki smo jih nato s PCR amplificirali ter podaljšali, da smo dobili ustrezne komponente za sistem scCRISPR. Po tem, ko smo pripravili vse komponente in preverili njihovo ustreznost, smo z različnimi metodami optimizirali učinkovitost transfekcije pri obeh celičnih linijah. Plazmida in konstrukta sgRNA smo nato z načinom, ki se je izkazal za najbolj učinkovitega, vnesli v celice in preverjali, če so komponente sistema scCRISPR povzročile izbitje genske gruče SNORD116 v celičnem okolju. Za preverjanje smo uporabljali posamezne izolirane klone, pri katerih smo s specifičnimi začetnimi oligonukleotidi analizirali spremembe na genomski DNA na lokusu PWS. Izbitje genske gruče SNORD116 ni bilo uspešno pri nobeni od izbranih celičnih linij, najverjetnejši vzrok za negativen rezultat pa je prenizka učinkovitost transfekcije. Kljub temu, da nismo uspeli izdelati željenih celičnih modelov, smo v diplomskem delu uspešno vzpostavili sistem in metode potrebne za spreminjanje genoma s sistemom CRISPR/Cas9. Poleg tega smo optimizirali metode za preverjanje vnosa mutacij in selekcioniranja ter generiranja posameznih klonov. Naše ugotovitve bodo služile kot osnova za nadaljnje poskuse izbitja večjih genskih segmentov v celičnem okolju in s tem generiranjem modelov, ki nam bodo v prihodnje pomagali pri odkrivanju biološke vloge te enigmatične genske gruče.20202020-09-11 10:05:00Diplomsko delo/naloga119798sl