Določanje izražanja mRNA alfa-7 nikotinskih receptorjev v krvi pri človekuŠtrancar, Urša (Avtor) Kovačič, Uroš (Mentor) holinergični protivnetni odzivalfa-7 nikotinski receptorPBMCZa uspešno uravnavanje vnetnih reakcij pri poškodbah ali infekcijah je pravilno delovanje vnetnih in protivnetnih mehanizmov imunskega sistema ključnega pomena. Vnetje je pri zdravem človeku uravnavano s pravilnim razmerjem v količini vnetnih in protivnetnih mediatorjev, saj tako ne pride do prekomernega sistemskega vnetja ali sepse. Izločanje vnetnih in protivnetnih molekul nadzorujeta humoralni sistem (kortizol) preko hipotalamo-hipofizo-suprarenalne osi in živčni sistem preko živca vagusa. V zadnjih dvajsetih letih so znanstveniki iz različnih laboratorijev po svetu poročali o najrazličnejših odkritjih, ki so privedle do razumevanja mehanizma in pomena novo odkritega holinergičnega protivnetnega odziva, ki ga nadzira živec vagus. Holinergični protivnetni odziv temelji na aktivaciji živca vagusa ter prenosu signala na vranični živec, pri čemer se iz perifernih živčnih končičev slednjega v vranici sprošča noradrenalin, ta pa stimulira podvrsto limfocitov T, da v vranici začnejo sintetizirati in izločati acetilholin. Acetilholin se veže na α7 nikotinske receptorje na makrofagih in preko različnih mehanizmov preprečuje izločanje vnetnih citokinov. Določanje izražanja mRNA alfa-7 nikotinskih receptorjev v periferni krvi bi bila lahko dokaj enostavna metoda, s katero bi pri človeku lahko določali aktivnost holinergične protivnetne poti v različnih bolezenskih stanjih. V metodologiji smo predlagali protokol dela za vzpostavitev rutinskega merjenja izražanja mRNA α7 nikotinskih receptorjev, ki zajema izolacijo PBMC iz človeške krvi, izolacijo RNA in dvostopenjski RT-PCR. To bi lahko postalo uporabno metodološko orodje za klinične raziskave, s časom pa potencialno tudi kot rutinski diagnostični biomarker stanja holinergičnega protivnetnega odziva. Ugotovitve glede postopkov izolacije PBMC in RT-PCR smo primerjali z metodologijo izolacije, ki so jo opisali v raziskavah, kjer so raven izražanja mRNA nikotinskih acetilholinskih receptorjev v celicah iz periferne krvi pri bolnikih že določali. Nova in do sedaj redko uporabljena je metoda imunomagnetne negativne selekcije z EasySep, ki temelji na označevanju krvnih celic z monoklonskimi protitelesi in njihovo izolacijo s pomočjo magnetnih delcev. Ta metoda se zdi še posebej uporabna, saj hitro in v zadostni količini omogoča izolacijo specifičnih podvrst limfocitov kot tudi monocitov. S predlagano metodologijo qPCR želimo ugotavljati razlike v izražanju gena za α7 nikotinski receptor pri bolnikih z različnimi oblikami in jakostjo vnetja v primerjavi z zdravimi.20202020-09-08 13:05:00Diplomsko delo/naloga119405sl