Izolacija in karakterizacija mutantov aneksina A11 D40G in ΔN1-118Supej, Špela (Avtor) Župunski, Vera (Mentor) aneksin A11amiotrofična lateralna sklerozaizolacija proteinamutacija D40GAmiotrofična lateralna skleroza (ALS) je neozdravljiva nevrodegenerativna bolezen, ki jo povzroči progresivna degeneracija motoričnih nevronov v možganski skorji, možganskem deblu in hrbtenjači. Bolezen so do sedaj povezali z mutacijami več kot 100 genov, med drugimi tudi z mutacijami na genu ANXA11. Aneksin A11 (ANXA11) je 505 aminokislinskih ostankov dolg protein, ki spada v naddružino aneksinov in se v odvisnosti od kalcija veže na fosfolipidne membrane. Protein se deli na dva strukturno povsem različna dela. Na C-koncu vsebuje štiri aneksinske ponovitve, sestavljene iz petih α-vijačnic, N-končna regija pa je v primerjavi s C-končno izredno variabilna in neurejena. Struktura N-končnega repa zaradi svojih intrinzičnih lastnosti še ni bila določena. V okviru diplomskega dela smo želeli pridobiti večje količine skrajšane oblike proteina, ki je imel N-končno domeno skrajšano za prvih 118 aminokislin do Ser119 (označili smo ga ANXA11dN1-118), in ANXA11dN-ter, ki je bil skrajšan do Gly179. Zapisa za rekombinantni obliki proteina smo z metodo od ligacije neodvisnega kloniranja LIC vnesli v bakterijska ekspresijska vektorja pMCSG7 in pMCSG7-GST. Zanimalo nas je, ali bo oznaka GST pomagala pri povečanju topnosti proteina in zmanjšala njegovo cepitev, ki se je pojavila v predhodnih poskusih z drugimi vektoji. Obe obliki smo izrazili v bakterijskih celicah E. coli seva BL21 [DE3] pLysS in ju izolirali s postopkom nikljeve afinitetne kromatografije. Uspelo nam je pridobiti 19,2 mg proteina ANXA11dN1-118 in 6,4 mg ANXA11dN-ter, kar je zadostovalo za nadaljnje kristalizacijske poskuse. Med izolacijo ni prihajalo do cepitve proteinov. Prav tako smo v protein ANXA11 divjega tipa s pomočjo mestnospecifične mutageneze uvedli mutacijo D40G, ki je najpogostejši povzročitelj bolezni ALS v evropski populaciji.20202020-09-08 07:35:00Diplomsko delo/naloga119320sl