Standardizacija protokola meritev L-laktata v posamezni celici 3T3-L1Maver, Anja (Avtor) Zorec, Robert (Mentor) 3T3-L1laktatni receptorL-laktatfototoksičnostL-laktat je pomemben metabolit, ki nastaja pri anaerobni in aerobni glikolizi ter ima ključno vlogo pri celični presnovi in signalizaciji. V celicah aktivira laktatne receptorje, med katere spada tudi GPR81; slednji je prisoten v astrocitih v možganskem tkivu. Raziskava, pri kateri so proučevali astrocite z izbitim genom za GPR81, je pokazala, da so v astrocitih poleg GPR81 prisotni tudi drugi, še neidentificirani laktatni receptorji. Za identifikacijo le-teh so potrebne nadaljnje študije, pri katerih bi preko nanosenzorjev FRET s fluorescenčno mikroskopijo merili spremembe citosolnega L-laktata v celicah v mirovanju ali po stimulaciji z zunajceličnim L-laktatom oz. ligandi Smart. Meritve s fluorescenčno mikroskopijo vključujejo osvetlitve celic, pri čemer je pomembno, kolikšna je intenziteta svetlobe ter kolikšni so ekspozicijski časi ekscitacije fluorescence. Predolga ekspozicija celic na svetlobi ter previsoka intenziteta svetlobe povzročata fototoksične učinke na celice, kar se pozna pri kvaliteti eksperimentov. Postopek meritve citosolnega L-laktata je zato potrebno standardizirati in določiti, ali ekspozicijski čas ekscitacije fluorescence, ki ga uporabljamo pri eksperimentih, signifikantno vpliva na odzive celic po stimulaciji z 20 mM zunajceličnim L-laktatom oz. ligandom Smart009 ali Smart075 v koncentracijah 1000 µM in 500 µM. Da bi določili, ali ta odvisnost obstaja, smo celice 3T3-L1 WT in 3T3-L1 KO19 transficirali z nanosenzorjem FRET Laconic, ki detektira L-laktat v fiziološkem obsegu, ter jih stimulirali z zunajceličnim L-laktatom oz. ligandoma Smart. Pri tem smo s fluorescenčnim mikroskopom zajemali slike pri različnih ekspozicijskih časih ekscitacije fluorescence ter ustvarili posnetke celic v realnem času. Iz analize posnetkov smo dobili spremembe v signalu FRET, ki kažejo spremenjeno citosolno koncentracijo L-laktata oz. t. i. odziv celice. Podatke o ekspozicijskih časih smo za posamezno celico združili s podatki o spremenjenem signalu FRET in združene podatke nato analizirali s testom linearne regresije. Pri statistični analizi so nas zanimali korelacijski faktor r, vrednost P in determinacijski koeficient r2. Rezultati kažejo, da spremembe v signalu FRET niso v nobenem primeru stimulacije statistično signifikantno odvisne od ekspozicijskega časa.20202020-08-31 15:25:02Diplomsko delo/naloga118760sl