Vzpostavitev sistema za spremljanje regulacije izražanja toksin-antitoksin modulov in vivo.Živič, Zala (Avtor) Hadži, San (Mentor) Klemenčič, Marina (Komentor) toksin/antitoksinregulacija izražanjahigBA2HigB2HigA2Sistemi toksin/antitoksin so bakterijski in arhejski operoni, ki so namenjeni ohranjanju celične populacije. Zapisujejo za proteinski toksin, ki s svojim delovanjem vodi v celično smrt ali pa zastoj metabolizma in proteinski/RNA antitoksin, ki nasprotuje delovanju toksina. V okviru magistrskega dela smo se osredotočali na sistem tipa II higBA2. Vsebuje zapis za proteina toksin HigB2 in antitoksin HigA2. Predlagan model samoregulacije tega sistema toksin/antitoksin predvideva mehanizem uravnavanja preko razpoložljivosti neurejenega N-konca HigA2. V prisotnosti toksina HigB2 je ta vezan nanj kar ošibi vezavo HigA2 na DNA. Promotor phigB-2 se sprosti in izražanje operona je omogočeno. Model regulacije sistema je bil določen in vitro. Želeli smo sestaviti sistem za preverjanje modela in vivo s pomočjo reporterskega proteina mRFP1 pod nadzorom phigB-2 ter HigB2 in HigA2 pod ločenimi konstitutivnimi promotorji. V ta namen smo želeli z molekularno biološkimi metodami povečati nabor že narejenih vektorjev. Prav tako smo pripravili vektor s toksinom pod inducibilnim promotorjem. Sama restrikcija in mutageneza sta bili težavni. Pogosto se je z vektorja izgubil zapis za toksin, česar nismo želeli. Uspešno smo pridobili enega izmed vektorjev z zapisom za toksin in brez zapisa za antitoksin. Mutageneza ni bila uspešna. Sklepali smo, da je lahko težavna toksičnost toksina kljub temu, da se izraža njegova encimsko neaktivna mutanta. Razlog bi lahko bil v vezavi HigB2 na ribosom. Zato smo pripravili vektor s toksinom pod inducibilnim promotorjem, kjer pride do izražanja gena za toksin šele ob dodatku L-arabinoze. Izvedli smo preliminarne poskuse izražanja ter potrdili prisotnost proteina po indukciji s točkovnim nanosom. V sklopu tega dela smo torej uspeli pripraviti ustrezen nabor vektorjev, ki omogočajo izvebo indukcije in merjenje fluorescence mRFP1 z namenom karakterizacije pripravljenih sistemov in vivo.20202020-08-27 15:15:01Magistrsko delo/naloga118580sl