Biofizikalne in biokemijske lastnosti G4C2 ponovitev DNAŽbogar, Karmen (Avtor) Rogelj, Boris (Mentor) C9orf72Ponovitve G4C2G-kvadrupleksAmiotrofična lateralna skleroza (ALS) in frontotemporalna demenca (FTD) sta dve nevrodegenerativni bolezni, ki delita nevropatološke, klinične in genetske značilnosti. Pokazalo se je, da je razširjena heksanukleotidna ponovitev G4C2 znotraj gena C9orf72, najpogostejši genetski vzrok ALS in pomembno prisotna pri FTD. Zdravi posamezniki imajo do 23 ponovitev G4C2. Število pri bolnikih z ALS ali FTD znaša tudi do več 1000. Mehanizem z mutacijo v genu C9orf72 posredovane nevrodegeneracije ni popolnoma znan. V magistrski nalogi smo sprva z opazovanjem spremembe mobilnosti DNA na agarozni gelski elektroforezi (AGE) preučevali vplive temperature, pH in ionskih zvrsti na različno dolga zaporedja s ponovitvami G4C2 ter opazili očitne razlike v pogojih denaturacije med konstrukti, ki vsebujejo ponovitve G4C2 ter kontrolnimi konstrukti, ki so naključna zaporedja DNA, podobne dolžine kot preiskovani konstrukti. Razlike med kontrolnim zaporedjem in zaporedjem G4C2 smo pripisali GC bogatemu zaporedju. Pogoje denaturacije verig pridobljene na AGE smo potrdili z mikroskopijo na atomsko silo (AFM). Z gvanini bogata zaporedja tvorijo G-kvadruplekse, nekanonične sekundarne strukture sestavljene iz planarnih tetramernih kvartetov iz štirih zaporednih gvaninov. Doslej so pokazali tvorbo G-kvadrupleksov znotraj zaporedij, ki vsebujejo do 5 ponovitev G4C2. Vendar pa ostaja izziv potrditi tvorbo le-teh znotraj molekul DNA, ki vsebujejo večje število ponovitev. Zaporedja, ki vsebujejo 48 ponovitev G4C2, imajo večji biološki pomen, kot zaporedja z manjšim številom (< 24). Zato smo se v magistrski nalogi lotili dokazovanja tvorbe G-kvadrupleksov v zaporedju DNA z 48 ponovitvami G4C2 s CD-spektroskopijo ter detekcijo intenzitete fluorescence fluorescenčnega barvila, saj se mu ob vezavi na G-kvadrupleks le-ta poveča. Detekcija DNA G-kvadrupleksov s fluorescenčnim barvilom je dala obetavne rezultate, ki nakazujejo na prisotnost teh struktur v zaporedju s ponovitvami G4C2. Posneti CD-spektri so pokazali spremembo strukture DNA po denaturaciji tako pri kontrolnem zaporedju DNA kot pri zaporedju DNA s ponovitvami G4C2. Dodatno so CD-spektri zaporedja G4C2 vsebovali vrhove, ki kažejo na prisotnost G-kvadrupleksov znotraj ponovitev G4C2, medtem ko pri kontrolnem zaporedju teh vrhov nismo zaznali. Ker je bilo do danes narejenih veliko študij vpliva RNA G-kvadrupleksov na razvoj ALS ter FTD, smo detekcijo s fluorescenčnim barvilom izvedli tudi na RNA in zaznali prisotnost G-kvadrupleksov v G4C2 zaporedju RNA. Nazadnje smo pripravili z biotinom označene enojne verige DNA s ponovitvami G4C2, ki jih bomo v nadaljnjem delu uporabili za DNA test ˝pull down˝ z namenom identifikacije proteinov, ki se vežejo na omenjene konstrukte. Z namenom označevanja konstruktov DNA z biotinom smo optimizirali reakcijo PCR in uspešno pomnožili zaporedje s 100 % deležem GC.20202020-08-25 15:00:00Magistrsko delo/naloga118177sl