Vpletenost interlevkina 7 in avto-imunosti proti LL-37/CRAMP v proces aterosklerozeMihailović, Peter Marko (Avtor) Noč, Marko (Mentor) Dimayuga, Paul (Komentor) avtoimunskimehanizmiaterosklerozainterlevkin 7imunopeptidomp210ApoB-100LDLkeratin 8keratin IIbleomicin hidrolazaARID1AhCAP-18LL-37CRAMPApoE (-/-)miokardniinfarkt.Povzetek: Ateroskleroza je bolezen kopičenja maščobnih delcev v žilno steno arterij. Po svoji naravi je progresivna bolezen, ki jo zaznamuje večanje aterosklerotičnega plaka do točke ko le-ta poči in vsebina izpostavi krvnemu obtoku. To na mestu razpoke povzroči nastanek strdka, ki lahko posledično zapre ali zoži arterijo do te mere, da lahko privede do ishemije tkiva katerega taka arterija prehranjuje. Pri srcu to pomeni ishemijo srčne mišičnine – miokardni infarkt. Ob miokardnem infarktu se v sistemsko cirkulacijo zaradi nekroze srčne mišice izločajo vnetni mediatorji, ti pa vplivajo na večje vnetje v aterosklerotičnih lehah na kar kažejo slikovne študije ožilja po ishemičnem dogodku. Klinično to vidimo tudi v povečanem tveganju za ponovni ishemični dogodek, najvišje v roku enega leta po miokardnem infarktu. Na to kažejo podatki iz številnih epidemioloških študij s celega sveta. Modulacija vnetja po miokardnem infarktu lahko zmanjša tveganje za ponovni dogodek, kar so pokazali podatki tako iz predkliničnih kot tudi iz kliničnih študij. V prvem delu doktorske teze predstavim novo pot imunomodulacije po miokardnem infarktu z inhibicijo receptorja za interlevkin 7. V živalski študiji na miših z aterosklerotično boleznijo in pridruženim miokardnim infarktom pokažem, da interlevkin 7 deluje kot monocitni kemotaktični dejavnik, da je količina interlevkina 7 po miokardnem infarktu v žilni steni povišana ter, da se po miokardnem infarktu poveča sinteza mRNA interlevkina 7 v samem ishemično prizadetem miokardu. Imunomodulacija vnetja z inhibitornim monoklonskim protitelesom proti receptorju interlevkina 7 zmanjša kopičenje maščob v žilni steni ter infiltracijo vnetnih celic, predvsem monocitov in makrofagov, kar pomeni zmanjšanje vnetja in stabilizacijo plaka. V prvem delu doktorskega dela tako pokažem doprinos in pomen vnetja in prirojenega imunskega sistema v proces ateroskleroze. Imunski sistem v grobem sestavljata prirojeni imunski sistem, katerega sestavni del so celice kot so monociti in makrofagi, udeleženi v proces ateroskleroze tako v akutni kot kronični fazi bolezni ter pridobljeni imunski sistem. Po začetni, nespecifični fazi vnetja pride do aktivacije specifičnega, pridobljenega dela imunskega sistema, katerega predstavniki so med drugim limfociti T, limfociti B ter antigen predstavitvene celice. Značilnost tega dela imunskega sistema je tarčno, antigensko specifično vnetje, za katerega so značilne interakcije med receptorji na celicah T in MHC molekulami na antigen predstavitvenih celicah. Znano je, da pri procesu ateroskleroze pride do aktivacije avto-reaktivnih limfocitov T in B in specifičnega odziva le-teh proti maščobnim delcem v aterosklerotičnih lehah. En takih delcev je peptid p210, ki je del molekule ApoB100, sestavni del delcev LDL, glavnih krivcev za nastanek vnetja v žilni steni. Raziskave so pokazale obstoj LDL in apoB-100 reaktivnih celic T, vendar do sedaj specifični epitopi pomembni pri aterosklerozi še niso bili potrjeni. V drugem delu doktorskega dela pokažem prisotnost avtoreaktivnih, antigen specifičnih CD8+ limfocitov T, pri katerih stimulacija s peptidom p210 izzove avto-imunski odziv. Avto-imunski odziv temelji na prepoznavi kompleksa antigen-MHC-I molekula s strani celičnega receptorja T. S pomočjo IEDB baze (Immune Epitope Data Base) smo preverili predvideno vezavo peptidnega fragmenta p210 na mišje molekule MHC-I. Na podlagi izbranega peptidnega fragmenta z visoko predvideno vezavno afiniteto na MHC-I smo izdelali fluorescenčno označen pentamer sestavljen iz petih MHC-I molekul, specifičnih za p210 fragment in preverili prisotnost CD8+ celic T, ki se na pentamer vežejo ob specifični prepoznavi epitopa p210. Miši, ki so prejemale aterogeno dieto z visoko vsebnostjo maščob, so izražale večji delež pentamer pozitivnih CD8+ celic T, ki so imele izražen efektorski fenotip. Te celice se ob stimulaciji s peptidom p210 klonalno razmnožijo, kar je značilnost specifične razpoznave antigena s strani T-celičnega receptorja (TCR). Imunomodulacija z imunizacijo s p210 je povečala delež p210-specifičnih pentamer pozitivnih CD8+ limfocitov T in zmanjšala breme ateroskleroze. Interakcija CD8+ limfocitov T z antigen predstavitvenimi celicami temelji na vezavi antigenskega peptida z vezavnim mestom MHC-I molekule na površini antigen predstavitvenih celic in prepoznavi kompleksa antigen/MHC-I s strani T-celičnega receptorja CD8+ limfocitov T. Znano je, da se MHC-I molekule pri bolezenskih stanjih izločajo v krvni obtok. Te topne MHC-I molekule na svoji površini oz. vezavnem mestu nosijo peptidne fragmente, ki predstavljajo potencialne avto-antigene udeležene v boleznska stanja. Z analizo in identifikacijo peptidov, vezanih na topne MHC-I molekule, lahko prepoznamo antigene pomembne pri procesu ateroskleroze in miokardnega infarkta. V tretjem delu teze predstavim novo metodo odkrivanja potencialnih avto-antigenov udeleženih v proces ateroskleroze in po miokardnem infarktu in prikažem translacijski pristop testiranja relevantnosti odkritih peptidov v biološkem modelu ateroskleroze in miokardnega infarkta. Z metodo imunoprecipitacije smo iz krvi pacientov z akutnim koronarnim sindromom pridobljene v AZACS študiji, ki imajo dokazano aterosklerozo, izolirali peptide, ki so bili ob primerjavi z zdravimi kontrolami specifični za paciente. Peptide smo identificirali s pomočjo masne spektrometrije in primerjave aminokislinskega zaporedja z bazo človeških proteinov Uniprot. S to metodo smo odkrili več potencialnih avto-antigenov udeleženih v proces ateroskleroze in miokardnega infarkta. Za nadaljno testiranje biološkega pomena smo izbrali peptide specifične za paciente, ki so imeli na masni spektrometriji najvišjo intenzivnost signala, ali pa so bili skupni največjem številu pacientov (Keratin 8, ARID1A, Bleomicin hidrolaza ter LL-37). Mišje homologe teh peptidov smo testirali na živalskem modelu ateroskleroze ter ateroskleroze s pridruženim miokardnim infarktom. Od izbranih peptidov sta keratin II (mišji analog človeškemu keratinu 8) ter CRAMP (mišji analog človeškemu LL-37) izzvala največji imunski odziv. Keratin II je v mišjem ApoE(-/-) modelu ateroskleroze izzval predvsem efektorski odziv CD8+ limfocitov T, katerega ni bilo videti v mišjem ApoE(-/-) modelu ateroskleroze s pridruženim miokardnim infarktom. To je bilo razvidno tudi ob stimulaciji perifernih mononuklearnih celic izoliranih iz krvi pacientov s stabilno koronarno boleznijo in pacientov z akutnim koronarnim sindromom. Antimikrobni peptid LL-37, fragment proteina hCAP18, ki se nahaja v granulah nevrofilnih granulocitov in igra pomembno vlogo pri nevtrofilnem vnetju, je znan avto-antigen pri avtoimunih boleznih kot je luskavica. Pacienti z luskavico imajo večje breme ateroskleroze kot splošno, zdravo prebivalstvo in pridruženo višje tveganje za srčno-žilne dogodke. Bolniki z dokazano aterosklerozo imajo po drugi strani dvakrat višjo prevalenco luskavice kot zdravo prebivalstvo. Poleg tega je LL-37 moč najti v aterosklerotičnih lehah. Pomanjkanje mišjega ekvivalenta LL-37, imenovanega CRAMP (Cathelicidin Related Antimicrobial Peptide) v mišjem modelu zmanjša aterosklerotično breme. V namen proučevanja vpletenosti CRAMP v proces ateroskleroze pri miših smo sintetizirali skrajšano različico molekule (tCRAMP – truncated CRAMP), ki je vsebovala predvidena vezavna mesta za mišje MHC-I molekule. Stimulacija mišjih imunskih celic je izzvala močan efektorski odziv celic T, ki je bil še posebej poudarjen pri miših z razširjenim aterosklerotičnim bremenom po hranjenju z dieto bogato z maščobami. V odziv sta bili udeleženi tako CD4 kot tudi CD8 T-celična vrsta. Z imunizacijo kot način imunomodulacije smo preverili pomen tCRAMP antigena pri aterosklerozi. Izbrali smo dve imunizacijski dozi, višjo (100ug) in nižjo (20ug), ki sta imeli zelo različen biološki odziv. Nižja imunizacijska doza je preko povečanja deleža CD8+ celic T centralnega spomina ter znižanja deleža vnetnih dendritičnih celic CD11b+ zmanjšala breme aterosklerotične bolezni. Višja imunizacijska doza pa je, ravno obratno, povečala breme aterosklerotične bolezni in povzročila avto-imunsko preobrazbo imunskega sistema. Videti je bilo povišanje avto-reaktivnosti, predvsem z večjim deležem tako CD4+ kot CD8+ efektorskih celic T kot tudi povečanje deleža dendritičnih celic CD11b+, klasično celic vnetnega fenotipa. V doktorski tezi pokažem pomen tako prirojenega kot pridobljenega imunskega sistema v procesu ateroskleroze in vnetja po miokardnem infarktu ter potencialne nove načine imunomodulacije, ki se lahko uporabljajo za zmanjšanje bremena ateroskleroze. Teza predstavi pomen interlevkin 7 vnetne poti in vpletenost le-te v vnetje po miokardnem infarktu. Inhibicija receptorja interlevkina 7 zmanjša posti-ishemično vnetje v aterosklerotičnih lehah. Monoklonska protitelesa proti interlevkinu 7 so bila že prestala varnostno klinično študijo in predstavljajo zanimivo priložnost za klinično uporabo imunomodulacije po miokardnem infarktu. Doktorsko delo je pomembno tudi zaradi predstavitve novega načina raziskovanja avto-antigenov udeleženih v proces ateroskleroze. Določanje imunopeptidoma iz krvi pacientov s koronarno boleznijo je izvedljivo in privede do odkrivanja antigenov biološkega pomena. Predstavim tudi pomembno translacijsko pot raziskovanja in testiranja teh antigenov v pristopu, ki vodi od pacienta do laboratorijskega testiranja hipoteze in nazaj do pacienta in omogoča pridobivanje potencialno pomembnih kliničnih odkritij. V svojem delu tako s translacijskim pristopom pokažem poglobljen pomen avto-antigena LL-37 odkritega v vzorcih krvi pacientov po akutnem koronarnem sindromu v procesu ateroskleroze.20202020-07-29 08:15:03Doktorsko delo/naloga117824sl