Sintezno biološki pristop za pojasnitev mehanizma delovanja in uporabo listeriolizina OAden, Saša (Avtor) Anderluh, Gregor (Mentor) listeriolizin OporeGUVproteinska logična vratasintezna biologijaListeriolizin O je prav poseben predstavnik družine od holesterola odvisnih citolizinov, katerega stabilnost je odvisna od pH in temperature. V bioloških sistemih je to ključna lastnost, ki pomaga bakteriji Listeria monocytogenes, da se širi po gostiteljevem organizmu. LLO je aktiven pri nizkem pH znotraj gostiteljevega fagolizosoma, kar omogoča bakteriji pobeg, medtem ko pri fiziološkem pH in temperaturi 37°C hitro agregira. Namen doktorskega dela je bilo natančneje preučiti mehanizem, s katerim LLO deluje na lipidne membrane ter te lastnosti uporabiti za aplikacije v sistemih z vezikli. Vpliv LLO na lipidne membrane smo preučevali s pomočjo modelnih membranskih sistemov, GUV-ov, z metodama pretočne citometrije in konfokalne fluorescenčne mikroskopije. Prišli smo do ugotovitev, da LLO poškoduje membrane, ki vsebujejo zadostno količino holesterola, v tolikšni meri, da vodi do propada veziklov. V biološkem sistemu to pomeni, da uničujoč učinek LLO vodi do propada fagolizosomov, kar omogoči bakteriji pobeg. Do zanimivega odkritja smo prišli tudi pri poskusih vezave LLO na arheosome, kjer se je LLO lahko vezal na arheosome, sestavljene izključno iz arhejskih lipidov. To kaže na to, da LLO poleg holesterola lahko prepoznava dodatno vezavno mesto na membranah, najverjetneje sladkor na glavah arhejski lipidov. S sintezno biološkimi pristopi smo poskusili pripraviti modelne sisteme, ki bi se specifično odzivali na spremembe v okolju z aktivacijo LLO in sproščanjem vsebine veziklov. Uspelo nam je pripraviti ogromne umetne vezikle iz arhejskih lipidov, znotraj katerih smo z IVTT uspeli proizvesti fluorescenčne fuzijske proteine z LLO oziroma Y406A. To je pomemben dosežek pri razvoju stabilnejših membran umetnih celic in korak naprej pri uporabi CDC-jev v takšnih sistemih. Sistem, ki je bil sposoben specifičnega odzivanja na spremembe v okolju, smo pripravili z uporabo proteinskih logičnih vrat na membrani veziklov. Uporabili smo od pH odvisen mutant LLO Y406A ter njegov inhibitor DARPin D22. Uspeli smo pripraviti sistema z dvema različnima logičnima funkcijama. AND logična vrata so pogojevala delovanje Y406A s prisotnostjo nizkega pH ter MMP-9. Slednja je bila potrebna za cepitev D22 is površine veziklov. OR-AND logična vrata so aktivirala tvorbo por Y406A ob cepitvi D22 is površine veziklov z reducentom TCEP ali proteazo MMP-9, in zakisanju okolice. Sintezno biološke sisteme, ki smo jih razvili, bi bilo možno uporabiti kot naprave za in vitro in in vivo dostavo, detekcijo, diagnostiko in kot ogrodje za nadaljnji razvoj umetnih celic ter membranskih sistemov z logičnimi vrati.20202020-07-15 07:16:13Doktorsko delo/naloga117536sl