Molekulsko kloniranje in priprava rekombinantnih variant proteinov Cas9 in ExoIII v bakteriji Escherichia coliKobal, Anja (Avtor) Dolinar, Marko (Mentor) rekombinantni proteiniovita vijačnicaizolacija proteinovCRISPR/Cas9sintezna biologijaPriprava in izolacija rekombinantnih proteinov je eden od najpogostejših postopkov v raziskavah na področju ved o življenju. Kljub njegovi široki razširjenosti pa vsak protein zahteva individualizirano izvedbo fermentacije in izolacije, ki jo določamo preko sistematičnega testiranja pogojev gojenja bakterijskih celic pred in po indukciji izražanja proteina. Ti pogoji so odvisni od lastnosti posameznega proteina. Protein Cas9 predstavlja eno od ključnih komponent sistema CRISPR/Cas9, ki se v zadnjem času vse bolj uveljavlja kot orodje za urejanje genoma. Njegova povezava z eksonukleazo III (ExoIII) predstavlja možnost za izboljšanje sistema, in sicer preko povečanja vrzeli na mestu dvojnega preloma, ki ga povzroči Cas9. Na ta način pride do izbrisa večjega dela gena in posledično večje uspešnosti njegovega izbitja (ang. knock-out). V okviru diplomske naloge smo pripravili nukleotidna zaporedja z zapisom za rekombinantna proteina Cas9 in ExoIII z dodanim zapisom za α-vijačnico na 3' koncu genskega konstrukta. Uporabili smo dva para ortogonalnih α-vijačnic. Te se ob vnosu obeh izoliranih proteinov v celico združijo v ovito vijačnico in na ta način povežejo proteina. Zapise za proteine smo vstavili v ekspresijski vektor pET-28b-Cas9-His ter z njimi transformirali ustrezne ekspresijske seve E. coli. Po fermentaciji smo proteine preko histidinske oznake izolirali z nikljevo afinitetno kromatografijo ter jih skoncentrirali. Tako pripravljeni vzorci so primerni za testiranje učinkovitosti povezave Cas9 – ExoIII ter potencialno uporabo v poskusih urejanja genoma.20202020-07-10 14:15:01Diplomsko delo/naloga117455sl