Ovrednotenje vpliva aktivacije z AMP aktivirane protein kinaze na inflamasom NLRP3Miklavčič, Rok (Avtor) Hafner Bratkovič, Iva (Mentor) Gunčar, Gregor (Komentor) NLRP3inflamasomstaranjeAMPKavtofagijaInflamasom NLRP3 je večproteinski kompleks prirojene imunosti in služi za aktivacijo kaspaze 1, ki proteolitično aktivira IL-1β, IL-18 in gasdermin D. Po aktivaciji NLRP3 se zreli obliki interlevkinov sprostita v okolico celic preko por gasdermina D ali zaradi nekroze in sprožita vnetje. Sestavljanje kompleksa sprožijo mnogi PAMP-i in DAMP-i, ki delujejo po kanonični, nekanonični ali alternativni poti aktivacije NLRP3. Delovanje inflamasoma NLRP3 je povezano tudi s sterilnim kroničnim vnetjem v starosti in spremlja starostne bolezni, kot so diabetes tipa 2, Alzheimerjeva bolezen ter ateroskleroza. Trenutno še ni jasno, katera od aktivacijskih poti inflamasoma sodeluje pri tem učinku, slabo pa je razjasnjena tudi sama regulacija delovanja inflamasoma NLRP3. Namen našega dela je bil sistematično ovrednotiti učinek spojin, ki podaljšujejo življenje, na kanonično, nekanonično in alternativno aktivacijo inflamasoma NLPR3, da bi pridobili informacije o regulaciji delovanja NLRP3 pri staranju. Za delo smo izbrali spojine, ki so preko aktivacije AMPK ali avtofagije podaljšale življenjsko dobo modelnih organizmov. Pri celicah iBMDM smo uspešno vzpostavili protokol za nekanonično aktivacijo NLRP3 s transfekcijo LPS in protokol za alternativno aktivacijo NLRP3 s peptidoglikanom. Pokazali smo, da rapamicin, spermidin, spermin, resveratrol, kurkumin, metformin, AICAR in PT-1 inhibirajo zorenje IL-1β pri nekanonični aktivaciji NLRP3. Večina teh spojin je inhibirala tudi zorenje IL-1β pri alternativni aktivaciji NLRP3, vendar smo predvsem za spermin in spermidin pokazali, da ob daljši inkubaciji lahko delujeta citotoksično. Pri kanonični aktivaciji NLRP3 smo spremljali zorenje IL-1β le za metformin, spermidin in spermin, kjer smo sicer za spermin in spermidin opazili znižanje procesiranja IL-1β, vendar smo hkrati opazili tudi citotoksičnost pri danih pogojih. Zanimivo je posredni aktivator AMPK metformin nasprotno celo povečal celični odziv pri kanonični aktivaciji NLRP3. Drugi namen naloge je bil pripraviti celično linijo iBMDM, ki inducibilno izraža konstitutivno aktivno AMPK, pri kateri bi lahko preučevali učinek AMPK na NLRP3. Z molekulskim kloniranjem in retrovirusno transdukcijo smo uspešno pripravili celični liniji CA/iBMDM in nCA/iBMDM. Obe liniji izražata konstitutivno aktivno AMPKα1 (1-312) T183D, ki pa se razlikujeta na N-koncu. Pri obeh linijah smo s prenosom western potrdili, da lahko z doksiciklinom induciramo sintezo encimov CA-AMPK oziroma nCA-AMPK. Fiziološke aktivnosti encimov še nismo uspeli enolično potrditi, sta pa oba encima nakazala učinek na fosforilacijo ACC po indukciji z doksiciklinom. Pri delu smo določili dobre kandidate za nadaljnje testiranje inhibicije NLRP3 in preučevanje njegove regulacije pri vnetju, ki spremlja staranje. Poleg tega smo pripravili celični liniji, pri katerih bi lahko po optimizaciji indukcije preučevali učinek AMPK na delovanje inflamasoma NLRP3.20202020-07-10 10:40:01Magistrsko delo/naloga117445sl