Mehanizmi aktivacije in inhibicije inflamasoma NLRP3Sušjan, Petra (Avtor) Hafner Bratkovič, Iva (Mentor) Kronično vnetjeinflamasom NLRP3IL-1βmolekularni mehanizempeptidni inhibitorjikrvno-možganska pregradaVnetni odziv v okviru prirojene imunosti je ključnega pomena za uspešno spopadanje z vdorom patogenih organizmov in za regeneracijo poškodovanega tkiva. V ta namen so imunske celice opremljene z receptorji za zaznavanje molekul mikrobnega izvora in različnih nemikrobnih endogenih molekul. Eden najpomembnejših regulatorjev nemikrobnega vnetja v imunskih celicah je proteinski kompleks inflamasom NLRP3, ki se aktivira ob zaznavi molekul, kot sta ATP in mitohondrijska DNA, pa tudi raznovrstnih patoloških delcev, kot so amiloidni plaki pri nevrodegenerativnih boleznih, holesterolni kristali pri aterosklerozi ali azbestna vlakna pri azbestozi. Inflamasomski kompleks NLRP3 je sestavljen iz oligomera aktiviranih receptorjev NLRP3, okoli katerega se preko medproteinskih interakcij v domenah PYD in CARD nanizajo molekule adapterskega proteina ASC in molekule pro-kaspaze-1, ki po avtokatalitskem procesiranju v aktivno kaspazo-1 aktivirajo citokina IL-1ß in IL-18 ter piroptotično smrt. Mehanizem aktivacije senzorskega proteina NLRP3 ostaja neznan, kar otežuje razvoj selektivnih terapevtikov za številne bolezni, ki so povezane z njegovo prekomerno aktivacijo. V pričujočem doktorskem delu smo osvetlili nekatera odprta vprašanja v zvezi z začetnimi stopnjami aktivacije inflamasoma NLRP3. Na podlagi celičnih linij, ki so izražale himerne konstrukte NLRP3, pri katerih smo njegovo interakcijsko domeno PYD zamenjali z drugimi interakcijskimi domenami, smo ugotovili, da je domena NLRP3PYD pomembno vpletena v vzdrževanje neaktivne oblike senzorskega proteina NLRP3, saj se je njena zamenjava z različnimi domenami CARD odražala v konstitutivni aktivnosti inflamasoma. S pomočjo konstruktov, pri katerih smo interakcijsko domeno PYD povezali z različnimi oligomerizacijskimi domenami, smo raziskali tudi stehiometrijo senzorskega proteina NLRP3 in ugotovili, da je že povezava domen NLRP3PYD v trimer zadostna za aktivacijo inflamasoma NLRP3. V nadaljevanju nas je zanimala tudi struktura in razporeditev proteinov znotraj inflamasomskega kompleksa NLRP3. S superresolucijsko mikroskopijo 3D SIM fluorescenčno označenih proteinov znotraj kompleksa v živih celicah smo ugotovili, da oligomerizirani proteini ASC-GFP tvorijo visoko zamreženo strukturo z gosto sredico, v kateri se nahaja NLRP3. Spremljanje dinamike njegove tvorbe v realnem času pa je pokazalo, da se filamenti ASC-GFP v značilno kompaktno obliko kondenzirajo preko intenzivnega razvejanja filamentov, na kar pomembno vpliva domena ASCCARD. Na podlagi strukturnih in molekularno- bioloških študij proteinov, udeleženih v inflamasom NLRP3, ki so identificirale njihove interakcijske površine, smo načrtovali tudi peptidne inhibitorje inflamasoma NLRP3. Identificirali smo pet načrtovanih inhibitorjev, ki so inhibirali sproščanje IL-1ß, aktivacijo kaspaze-1 in oligomerizacijo ASC. Peptid iz segmenta ASCPYD/H2-H3, ki je inflamasom NLRP3 inhibiral selektivno, smo za morebitne terapevtske aplikacije na področju nevrodegenerativnih bolezni opremili s peptidnim zaporedjem Angiopep-2 in pokazali, da je tako opremljena različica inhibitorja ASCPYD/H2-H3 uspešno prehajala krvno-možgansko pregrado, obenem pa ni imela vpliva na njegov inhibitorni potencial. V tem doktorskem delu smo prispevali novo znanje o molekularnem mehanizmu aktivacije inflamasoma NLRP3 in načrtovali set peptidnih inhibitorjev, ki bi lahko predstavljali podlago za nove pristope k terapiji z inflamasomom NLRP3 povezanih bolezni.20202020-07-08 07:15:09Doktorsko delo/naloga117337sl