Tvorba dimernih proteinskih nanokletk z uporabo sistema SpyCatcher/SpyTag in proteinskega origamijaPavko, Neža (Avtor) Jerala, Roman (Mentor) bionanotehnologijaproteinski origamiobvite vijačniceSpyCatcherSpyTagNaravni proteini so biopolimeri različnih dolžin sestavljeni iz kombinacij 20 osnovnih aminokislin. Vseh možnih kombinacij aminokislinskih zaporedij, ki določajo različne oblike in funkcije proteinov, je bistveno več, kot jih najdemo v naravi. To je povod za oblikovanje drugačnih, v naravi še neodkritih proteinskih struktur z de novo sintezo proteinov, katere predstavnik je tudi proteinski origami z obvitimi vijačnicami. Proteinski origami lahko služi kot ogrodje za predstavljanje različnih proteinskih domen in posledično tvorbo kompleksnejših proteinskih struktur. V ta namen smo uporabili sistem SpyCatcher/SpyTag, za katerega je značilna spontana tvorba izopeptidne vezi. Cilj diplomske naloge je bil sinteza konstrukta, ki ima v enem od oglišč predstavljeno proteinsko domeno SpyCatcher, kot rekombinanten protein pripravljen z aerobnim bioprocesom v E.coli. Temu je sledila izolacija proteina z NiNTA afinitetno kromatografijo in gelsko filtracijo ter analiza le-tega z NaDS-PAGE. Pripravljen protein smo nato kombinirali s proteinoma SpyTag-RFP in Tet12SN-StStStR, ki vsebujeta eno oziroma tri domene SpyTag. Z analizo Native-PAGE in SEC-MALS smo uspešno potrdili aktivnost proteina Tet12SN-ScGG, ki je tvoril monokonjugat oz. dimer s SpyTag-RFP. Pri reakciji Tet12SN-ScGG s Tet12SN-StStStR pa je prišlo do nastanka mono-, di- in tri-konjugatov. Z eksperimentalnim delom smo potrdili hipotezo, da je s pomočjo domen SpyCatcher in SpyTag, predstavljenih v ogliščih proteinskih tetraedrov, mogoče tvoriti dimerno oziroma mono-konjugirano strukturo, še več, uspešno smo pripravili strukture sestavljene iz treh in štirih tetraedrskih podenot.[N. Pavko]20202020-07-05 07:15:58Diplomsko delo/naloga117309sl