Vrednotenje vsebnosti fosfatov in aminov v bakterijskem peptidoglikanu po različnih postopkih čiščenja in označevanje peptidoglikanaRistić, Slađana (Avtor) Mravljak, Janez (Mentor) peptidoglikanbiosintezna pot peptidoglikanatehojske kislineoznačevanje peptidoglikanaPeptidoglikan predstavlja ključno komponento bakterijske celične stene in se nahaja skoraj v vseh bakterijah. Sodeluje v številnih življenjsko pomembnih celičnih procesih za mikroorganizem in ima tudi pomembno zaščitno vlogo. Številni encimi, ki sodelujejo v biosintezi in razgradnji peptidoglikana predstavljajo pomembno tarčo v razvoju antibiotikov, ki lahko z zaviranjem teh encimov povzročijo lizo bakterijske celice. Namen magistrske naloge je bil ovrednotiti peptidoglikan z vidika vsebnosti fosfata, ki sovpada z vsebnostjo tehojske kisline in prostih aminskih skupin, ki pa odražajo poškodbe na peptidoglikanu. Vzorce peptidoglikana, ki smo jih vrednotili, so izolirali iz treh različnih sevov bakterij (S. aureus, B. subtilis, ΔSagB S. aureus) in nato liofilizirali, mi pa smo jih tretirali oz. očistili pod različnimi pogoji. Vsebnost fosfatov smo določali s priročnim enostopenjskim reagentom za določanje prostih fosfatov – reagentom BIOMOL® GREEN. Proste aminske skupine pa smo detektirali s pomočjo ninhidrinske reakcije. Testirali smo dve seriji vzorcev peptidoglikana. Po vrednotenju prve serije vzorcev smo ugotovili, da tisti, ki so bili tretirani s HF, vsebujejo najmanj fosfatov in prostih aminskih skupin. Tako so v drugi seriji vzorcev vse očistili s HF; razlika med njimi je bila v času tretiranja. Pri vzorcih, ki so jih tretirali 24 h, smo ugotovili najmanjše poškodbe peptidoglikana. V drugem delu eksperimentalnega dela smo se lotili označevanja peptidoglikana s fluorescenčno sondo (barvilom). Za označevanje smo izbrali najprimernejši peptidoglikan, tj. peptidoglikan z najnižjo vsebnostjo fosfatnih skupin in prostih aminskih skupin obenem. Označeni peptidoglikan je namreč substrat za encimski test na osnovi fluorescenčne detekcije, s katerim vrednotimo kinetiko izbranih encimov, ki razgrajujejo peptidoglikan. Najvišjo aktivnost smo določili pri encimu AtlA-gl, saj je najuspešneje cepil naš substrat. Pri ostalih dveh encimih (AtlE in SagB) je bila aktivnost komaj zaznavna. Spoznanje, da je najoptimalnejša metoda za čiščenje peptidoglikana 24 h tretiranje s HF, predstavlja pomembno izhodišče za pripravo vzorcev peptidoglikana, ki bi jih želeli v prihodnosti uporabiti za merjenje aktivnosti različnih encimov, ki sodelujejo v biosintezi oz. razgrajevanju te življenjsko pomembne komponente bakterijske celične stene.20202020-07-02 08:45:13Magistrsko delo/naloga117208sl