Produkcija in karakterizacija modificiranih oblik proteinskih plinskih veziklov v E. coliŠprager, Ernest (Avtor) Benčina, Mojca (Mentor) Novinec, Marko (Komentor) proteinski plinski vezikliGvpCmutageneza skupka gvpultrazvokProteinski plinski vezikli so cilindrične ali vretenaste votle nanostrukture prokariontskih mikroorganizmov s premerom 45 – 200 nm in dolžino 100 – 200 nm, napolnjene s plini in obdane s proteinsko steno, debelo 2 nm. Glavni strukturni protein predstavlja GvpA (ali paralogni GvpB), pri določenih vrstah mikroorganizmov pa plinski vezikli vsebujejo še pomožni strukturni protein GvpC, ki nekovalentno prečno poveže GvpA in proteinske plinske vezikle strukturno ojača. GvpC je možno rekombinatno izraziti z raznimi fuzijskimi partnerji in tako pripraviti funkcionalizirane plinske vezikle. V magistrskem delu je opisana priprava proteinskih plinskih veziklov z različnimi fuzijskimi oblikami GvpC v bakterijskih celicah Escherichia coli in karakterizacija njihove strukture ter oblike s presevno elektronsko mikroskopijo. Pokazali smo, da dodajanje proteinskih domen, kot je eGFP, h GvpC ne vpliva na njegovo sposobnost vezave na GvpB, hkrati pa se v tem primeru eGFP tudi pravilno zvije. S hkratnim heterolognim izražanjem skupka gvp iz Bacillus megaterium in modificiranih oblik GvpC iz Anabaena flos-aquae je možno v E. coli pripraviti poljubno funkcionalizirane proteinske plinske vezikle. Morfološko gledano so proteinski plinski vezikli iz B. megaterium pretežno vretenasti, medtem ko dodatek GvpC-RGD (RGD je peptidno zaporedje z visoko afiniteto do integrinov) povzroči nastanek daljših in cilindrično oblikovanih veziklov, ki so po velikosti in obliki bolj podobni nativnim iz A. flos-aquae. S fuzijo peptidnega zaporedja RGD in GvpC smo dosegli pripenjanje veziklov na membrano sesalskih celic HEK293, za samo upodabljanje vezave pa smo uporabili fluorescenčno mikroskopijo in fuzijski GvpC z eGFP in zaporedjem RGD. Z analizama SDS-PAGE in WB izoliranih in očiščenih proteinskih plinskih veziklov smo razkrili njihovo kompleksno proteinsko sestavo. Proteinski plinski vezikli imajo primerljive akustične lastnosti mikromehurčkom in so uporabni kot kontrastna sredstva v ultrazvočnem slikanju. Preverili smo, ali s peptidom RGD funkcionalizirani proteinski plinski vezikli lahko delujejo kot ojačevalci ultrazvočne stimulacije mehansko občutljivih ionskih kanalov. Z vezikli občutljivosti celic na ultrazvok nismo povečali, smo pa zaznali proženje sistema pred stimulacijo že ob sami vezavi veziklov. Preverili smo vpliv izbrisa posameznih genov v skupku gvp B. megaterium na heterologno izgradnjo proteinskih plinskih veziklov v E. coli. Posredno preko ocenjevanja sposobnosti plavanja transformiranih bakterij smo identificirali potencialno nepotrebne gene gvpR, gvpN, gvpT, gvpU, po izbrisu gvpR in gvpU pa smo zaznali tudi izgrajene vezikle.20202020-06-11 15:25:01Magistrsko delo/naloga116808sl