Vrednotenje DNA-specifičnosti in termične stabilnosti PhDKranjc, Jaka (Avtor) Ilaš, Janez (Mentor) Loris, Remy (Komentor) proteinitoksin-antitoksinizotermalna titracijska kalorimetrijatermodinamikainterakcije z DNABakterijska persistenca je pojav, pri katerem se celicam spremenijo morfološke lastnosti in vstopijo v fazo mirovanja. S tem močno povečajo svojo odpornost proti zunanjim stresnim dejavnikom (kot so protimikrobne učinkovine, povišana ionska jakost, pomanjkanje hranil, UV sevanje), saj le-ti ne morejo vstopiti v celico. Bakterijski sistemi toksin-antitoksin so ena izmed metabolnih poti, ki v bakterijski celici sprožijo persisterski odziv. Predmet te magistrske naloge je protein Phd, del sistema toksin-antitoksin Phd /Doc, ki se nahaja na bakteriofagu P1 v bakterijah E. coli. Cilj našega dela je bil odkriti vpliv mutacij v palindromnem zaporedju operatorja na vezavne lastnosti z antitoksinom Phd. Hkrati pa smo proučevali tudi vpliv ionske jakosti na sekundarno strukturo proteina ter na njegovo termično stabilnost. Za pridobitev čistega proteina Phd smo izvedli čiščenje z uporabo afinitetne kromatografije. Pri tem smo celični lizat bakterij E. coli, v katerem sta se nahajala Phd in Doc v obliki kompleksa, nanesli na kolono ter ju ločili z denaturacijo. Naslednji korak je bil analiza sekundarne strukture proteina v pufrih različne ionske jakosti z metodo CD spektroskopije. Da bi zagotovili optimalne pogoje pri izvedbi izotermalne titracijske kalorimetrije, smo poskusili določiti pufer, v katerem je protein Phd najbolj termično stabilen. V ta namen smo izvedli test toplotne stabilnosti. Vpliv mutacij v palindromičnem zaporedju DNA, na katerega se veže Phd, smo analizirali z uporabo izotermalne titracijske kalorimetrije. Z izbrano metodo določanje toplotne stabilnosti proteina ni bilo uspešno. Pri tem nas je verjetno oviral neurejen repni del proteina, ki nase veže barvilo, ki smo ga uporabili pri testu toplotne stabilnosti. Z meritvami, pridobljenimi z izotermalno titracijsko kalorimetrijo, smo ugotovili, da vsakršne mutacije v oligonukleotidnem zaporedju negativno vplivajo na vezavo Phd. S pomočjo spletne podatkovne baze Protein data bank smo pridobljene rezultate ovrednotili v povezavi z že znano kristalno strukturo proteina Phd v kompleksu z operatorjem.20202020-05-06 08:45:25Magistrsko delo/naloga115994sl