Preučevanje zgradbe plašča krompirjevega virusa Y in pripadajočih virusom podobnih delcevKežar, Andreja (Avtor) Podobnik, Marjetka (Mentor) virus Y krompirjavirusom podobni delcikrio-elektronska mikroskopijaanaliza posameznega delcahelična rekonstrukcijananobiotehnologijaKrompirjev virus Y (PVY) je eden najnevarnejših rastlinskih virusov in obenem najbolj pomemben virusni patogen krompirja. Virus povzroči ogromno škode na kmetijskih pridelkih, najbolj nevaren pa je različek PVYNTN, ki povzroča bolezen obročkaste nekroze gomoljev. PVY virioni so okrog 740 nm dolgi fleksibilni delci, sestavljeni iz okoli 2000 kopij plaščnega proteina (CP) ter virusne RNA. Heterologno izražanje CP-ja v bakterijskih celicah vodi v produkcijo virusu podobnih delcev (VLP), ki so sestavljeni le iz CP-jev v odsotnosti virusne RNA. Natančna zgradba fleksibilnih filamentoznih virusov do pred kratkim ni bila poznana, sedaj pa je razvoj krio-elektronske mikroskopije (krio-EM) omogočil določevanje zgradbe tudi tem virusom. Tekom doktorske naloge smo s krio-EM določili prostorsko zgradbo viriona PVYNTN z ločljivostjo 3,4 A ter virusu podobnega delca z ločljivostjo 4,1 A. CPPVY je sestavljen iz osrednje globularne regije ter iztegnjenih N- in C-končnih regij, ki mu omogočata prilagajanje zgradbe različnim vezavnim partnerjem ter sestavljanje v filament z edinstveno arhitekturo. CPPVY se namreč ob prisotnosti virusne RNA sestavijo okoli RNA v obliki vijačnice, medtem ko se v odsotnosti virusne RNA CP-ji med seboj povežejo v oktamerne obroče, le-ti pa se naložijo v dolge VLP-filamente. Vlogo iztegnjenih N- in C-končnih regij pri sestavljanju VLP-jev ter infektivnosti virusa smo preučevali z delecijskimi mutacijami plaščnega proteina v VLP-ju in virusu. Z biokemijsko in biofizikalno karakterizacijo smo pokazali, da je N-končna regija nujno potrebna za sestavljanje CP-jev v VLP-je, medtem ko delecija C-končne regije nima negativnega vpliva na sestavljanje. Po drugi strani pa smo z in planta poizkusi pokazali, da sta obe regiji ključni za infektivnost virusa. Virus z delecijo N-končnih 50 aminokislinskih ostankov na CP-ju (?N50-CP) je zmožen šibkega pomnoževanja RNA, vendar je njegovo širjenje po rastlini onemogočeno, medtem ko sta C-končni deleciji 40 oz. 60 aminokislinskih ostankov na CP-ju (?C40-CP in ?C60-CP) virusu preprečili že pomnoževanje virusne RNA. V nasprotju z ?N mutantom, smo pri ?C mutantih v homogenatu listov okužene rastline opazili VLP-jem podobne delce. Poznavanje tridimenzionalne zgradbe PVY-a ter pripadajočih VLP-jev predstavlja ključno osnovo za nadaljnji razvoj preventivnih strategij za zaščito rastlin in nanobiotehnoloških aplikacij na podlagi VLPPVY.20202020-04-10 07:15:04Doktorsko delo/naloga115055sl