Majhne nekodirajoče RNA zunajceličnih veziklov pri sladkorni bolezni tipa 1Tesovnik, Tine (Avtor) Battelino, Tadej (Mentor) Trebušak Podkrajšek, Katarina (Komentor) Sladkorna bolezen tipa 1avtoimunostzunajcelični veziklimiRNAregulacija imunskega sistemaTLR7/8.UVOD Sladkorna bolezen tipa 1 nastane kot posledica avtoimunskega uničenja celic beta Langerhansovih otočkov trebušne slinavke, ki izločajo glavni anabolni hormon inzulin. Zaradi pomanjkanja lastnega hormona inzulina so osebe s sladkorno boleznijo tipa 1 primorane doživljenjsko prejemati zdravljenje z dodajanjem eksogenih odmerkov inzulina in dosledno izvajati meritve krvnega sladkorja, s čemer lahko preprečijo oziroma odložijo nastanek zapletov sladkorne bolezni. Vzrok nastanka avtoimunosti še vedno ni pojasnjen, med drugim tudi zaradi pomanjkanja bioloških označevalcev za zgodnje odkrivanje bolezni in zaradi tkivne nedostopnosti celic beta Langerhansovih otočkov v človeškem organizmu. Zunajcelični vezikli so majhne sferične strukture, ki jih celice izločajo v zunajcelični prostor z namenom celične komunikacije in usklajenega delovanja organizma. Poleg vloge pri zagotavljanju normalnega delovanja organizma lahko zunajcelični vezikli in miRNA sodelujejo tudi pri patogenezi številnih bolezni. Z doktorskim delom smo poskušali opredeliti zunajcelične vezikle kot potencialne biološke označevalce in posrednike pri nastanku sladkorne bolezni tipa 1. METODE Prisotnost zunajceličnih veziklov v izolirani frakciji krvne plazme z verjetnim izvorom iz celic beta Langerhansovih otočkov smo dokazovali z označevanjem vzorcev s specifičnimi protitelesi in slikanjem s transmisijsko elektronsko mikroskopijo. Z metodo sekvenciranja naslednje generacije smo določali miRNA zunajceličnih veziklov izoliranih iz krvne plazme desetih posameznikov s sladkorno boleznijo tipa 1 ob izbruhu bolezni, desetih posameznikov z več kot deset let trajajočo boleznijo in desetih zdravih preiskovancev. Z namenom opredelitve miRNA zunajceličnih veziklov, ki so prisotni v krvni plazmi ob intenzivnem propadu celic beta, smo kronološko analizirali tudi vzorce zunajceličnih veziklov izoliranih iz krvne plazme dveh transplantirancev Langerhansovih otočkov. Vpliv izbranih različno izraženih miRNA smo določali z in vitro testiranjem na vzorcih polne krvi, pri čemer smo spremljali izražanje označevalca zgodnje aktivacije CD69 in citotoksičnosti CD107a celic imunskega sistema s pretočno citometrijo. S fluorescenčno označeno miRNA smo s pretočno citometrijo in fluorescenčno mikroskopijo opredeljevali kopičenje veziklov v krvnih celicah imunskega sistema. Aktivacijo krvnih celic imunskega sistema ob izpostavitvi z miRNA s sintetičnimi vezikli smo utišali z dodatkom inhibitorja endosomalnih TLR7/8 receptorjev in predpostavili potencialen model učinkovanja miRNA zunajceličnih veziklov na imunski sistem. Pri preiskovancih s sladkorno boleznijo tipa 1 smo dodatno opredelili tudi dolžine telomer, ki so tudi uravnavane z miRNA in veljajo za označevalce staranja organizma ter delovanja oksidativnega stresa. REZULTATI S transmisijsko elektronsko mikroskopijo smo dokazali prisotnost zunajceličnih veziklov v krvni plazmi, ki potencialno izvirajo iz celic beta Langerhansovih otočkov, kar nakazuje na možno komunikacijo celic beta z drugimi tkivi v človeškem telesu. S sekvenciranjem naslednje generacije smo določili različno izražene miRNA pri preiskovancih s sladkorno boleznijo tipa 1 in intenzivnemu propadu celic beta ob transplantaciji Langerhansovih otočkov. Na podlagi rezultatov primerjalnih analiz izražanja miRNA smo izbrali osem zvrsti miRNA (hsa-miR-122-5p, hsa-miR-192-5p, hsa-miR-193b-5p, hsa-miR-185-5p, hsa-miR-195-3p, hsa-miR-455-5p, hsa-miR-375-3p, hsa-miR-129-5p), ki smo jih s sintetičnimi vezikli izpostavili nativnim krvnim celicam oseb s sladkorno boleznijo tipa 1 in zdravih preiskovancev pri in vitro pogojih, kar je povzročilo aktivizacijo celic imunskega sistema. Aktivacija imunskega sistema se je odražala s povečanim izražanjem zgodnjega označevalca aktivacije CD69 in citotoksičnosti CD107a celic T CD4+ in CD8+ in naravnih celic ubijalk CD56+. Pokazali smo, da se vezikli preferenčno kopičijo v fagocitnih krvnih celicah, kjer se nahajajo TLR7 in TLR8 receptorji, ki so najverjetneje odgovorni za prepoznavanje vezikularnih miRNA. Vpletenost TLR7 in TLR8 smo dokazovali s TLR7/8 inhibitorjem klorokinom, ki je ob stimulaciji celic imunskega sistema z miRNA in sintetičnimi vezikli znižal aktivacijski odziv. Prepoznavanje človeških miRNA zunajceličnih veziklov v endosomalni poti fagocitnih celic s TLR7 in TLR8 sproži imunski odziv in aktivacijo efektorskih celic imunskega sistema. Rezultati naših raziskav so pokazali tudi razlike v izražanju miRNA, katerih vloga je že bila vpisana pri regulaciji dolžin telomer. Dolžine telomer pri preiskovancih s sladkorno boleznijo tipa 1 s slabo glikemično urejenostjo so se krajšale hitreje kot pri preiskovancih z dobro glikemično urejenostjo, k čemur so morda pripomogle tudi miRNA zunajceličnih veziklov. ZAKLJUČEK Rezultati naše raziskave nakazujejo na pomembno vlogo človeških miRNA pri regulaciji imunskega sistema in staranja organizma. miRNA zunajceličnih veziklov so lahko udeležene pri aktivaciji imunskega sistema in lahko pripomorejo k nastanku začetnega vnetja Langerhansovih otočkov. Človeške miRNA tako lahko sodelujejo pri razvoju avtoimunosti in nastanku sladkorne bolezni tipa 1. Raziskava dodatno razkriva potencialne tarče za preprečevanje in zdravljenje sladkorne bolezni tipa 1.20202020-04-05 07:15:09Doktorsko delo/naloga114974sl