Izražanje rekombinantne zunajcelične regije človeškega eritropoetinskega receptorja v periplazmi bakterije Escherichia coliHiti, Luka (Avtor) Bratkovič, Tomaž (Mentor) Molek, Peter (Komentor) Escherichia coliperiplazemsko izražanjeeritropoetinski receptorGlikoprotein eritropoetin je glavni humoralni dejavnik v telesu, ki s spodbujanjem eritropoeze povečuje oksiformno kapaciteto krvi. Takšno povečanje pozitivno vpliva na fizično vzdržljivost, zaradi česar se, kljub prepovedi s strani Svetovne protidopinške organizacije, nekateri športniki zatekajo k uporabi eritropoetina oz. substanc, ki oponašajo njegovo fiziološko delovanje. Dokazovanje prisotnosti takšnih – zlasti nizkomolekularnih – spojin je zaenkrat precej težavno in nezanesljivo, zaradi česar obstaja težnja po razvoju univerzalne testne platforme. Pri razvoju takšne testne platforme je bila ena izmed uporabljenih komponent tudi rekombinantna zunajcelična regija eritropoetinskega receptorja (EpoR), ki so jo pridobili s prehodnim izražanjem v sesalski celični liniji HEK 293T. Takšno izražanje je zahtevno, dolgotrajno in drago, zato smo želeli najti enostavnejši, hitrejši in cenejši način pridobivanja EpoR. Namen magistrske naloge je bilo poskusno pridobivanje EpoR z uporabo E. coli kot alternativnega ekspresijskega sistema sesalskim celicam HEK 293T. Glavna ovira bakterijskih ekspresijskih sistemov je, da v citoplazmi ne nudijo oksidacijskega okolja, ki ga EpoR potrebuje za pravilno zvijanje in tvorbo disulfidnih mostičkov. To omejitev smo poskusili odpraviti tako, da smo genskemu zapisu za EpoR na 5'-konec pripojili genski zapis za signalno zaporedje, ki po izražanju usmerja polipeptidno verigo v periplazemski prostor z oksidativnim okoljem. Po okužbi E. coli z bakteriofagnimi delci M13, ki so vsebovali fagmidni vektor pIT2/EpoR, smo, da bi določili optimalne pogoje za izražanje EpoR, najprej izvedli testno izražanje EpoR v različnih pogojih indukcije pri dveh različnih temperaturah. Nato smo izvedli izražanje v večji količini in produkt očistili s kovinsko-kelatno afinitetno kromatografijo in velikostno-izključitveno kromatografijo. Na koncu smo količino produkta ocenili kolorimetrično po Bradfordu, z merjenjem absorbance pri 280 nm in denzitometrično ter ocenili njegovo aktivnost s prilagojeno različico testa ELISA in jo primerjali z aktivnostjo EpoR, pridobljenega z izražanjem v sesalskih celicah HEK 293T. Tako koncentracija (~150 μg / 1 L kulture) kot aktivnost izraženega EpoR (~0,4 % v primerjavi s skoraj 100 % aktivnostjo EpoR, izraženega v HEK 293T) sta bili zelo nizki.20202020-02-27 08:35:27Magistrsko delo/naloga114407sl