Mehanizmi celične odpornosti v predhodno obsevanih tumorjih na elektrokemoterapijo s cisplatinom ali bleomicinomNikšić Žakelj, Martina (Avtor) Strojan, Primož (Mentor) Serša, Gregor (Komentor) Elektrokemoterapijaradiorezistencakemorezistencakarcinomi glave in vratucisplatinbleomicinpoškodbe DNAprivzem kemoterapevtikovIzhodišča: Elektrokemoterapija je učinkovita lokalna ablativna metoda za zdravljenje različnih vrst tumorjev, pri kateri se uporablja intratumorski ali intravenski vnos kemoterapevtikov (bleomicina ali cisplatina) v kombinaciji z elektroporacijo. Na učinkovitost elektrokemoterapije vplivajo tako pravilnost izvedbe terapije, kot tudi lastnosti samih tumorjev. Med drugim so v kliničnih študijah opažali slabši odgovor tumorjev, ki so bili predhodno že zdravljeni s kemo- ali radioterapijo. Eden izmed možnih vzrokov bi lahko bila pridobljena intrinzična rezistenca tumorskih celic na kemoterapevtike. Recidivni tumorji namreč izrastejo iz najbolj odpornih celic, ki so zaradi določenih prilagoditev, kot je boljše popravilo poškodb DNA, preživele predhodno obsevalno terapijo. Manj je znano, kako te spremembe vplivajo na kemorezistenco celic in posledično na rezistenco na elektrokemoterapijo. Namen: V doktorski nalogi smo se namenili raziskati mehanizme intrinzične kemo- in radiorezistence recidivnih tumorjev po predhodnem obsevanju, ki lahko vplivajo na učinkovitost elektrokemoterapije. Hipoteze: Preverjali smo dve hipotezi. (1) Slabša občutljivost radiorezistentnih tumorskih celic na elektrokemoterapijo je pogojena tudi z intrinzično rezistenco na cisplatin in bleomicin; in (2) Razvoj kemorezistence pri radiorezistentnih tumorskih celicah je pogojen tako s spremenjenimi mehanizmi popravila poškodb DNA, kot tudi s spremenjenim celičnim privzemom kemoterapevtikov. Materiali in metode: V naših poskusih smo primerjali dve izogeni humani celični liniji ploščatoceličnega karcinoma žrela: starševsko (FaDu) in radiorezistetno podlinijo (FaDu-RR), ki smo jo vzpostavili s frakcioniranim obsevanjem linije FaDu. S testom klonogenosti smo najprej določili stopnjo občutljivosti obeh celičnih linij na obsevanje, kontinuirano izpostavljenost cisplatinu ali bleomicinu, ter na elektrokemoterapijo. Za izvedbo in vivo poskusov smo s podkožnim injiciranjem ene ali druge celične linije na bok imunokompromitiranih (SCID) miši inducirali FaDu in FaDu-RR tumorje. Tumorska modela smo primerjali glede nekaterih histoloških značilnosti ter občutljivosti na obsevanje, kemoterapijo s cisplatinom, kombinacijo obsevanja in cisplatina ter elektrokemoterapijo. Učinek naštetih terapij smo spremljali z merjenjem zaostanka v rasti tumorjev v primerjavi s kontrolno skupino ter z izrisom krivulj preživetja. V drugem delu naloge smo celični liniji po izpostavitvi cisplatinu ali bleomicinu primerjali glede sposobnosti popravila dvojnih prelomov DNA (z imunocitokemičnim določanjem žarišč ?-H2AX) ter glede na izraženost genov za popravilo poškodb DNA (z metodo PCR). Z visoko specifičnimi analičnimi metodami, ki temeljijo na masni spektrometriji, smo primerjali tumorski privzem cisplatina in bleomicina po kemo- in elektrokemoterapiji. Rezultati: S frakcioniranim obsevanjem smo uspešno vzpostavili radiorezistentno celično linijo FaDu-RR z induciranimi obrambnimi mehanizmi, ki so poleg pridobljene radiorezistence vodili tudi do navzkrižne rezistence na cisplatin. Dodatno smo v in vivo pogojih dokazali večjo odpornost FaDu-RR tumorjev na kombinacijo frakcioniranega obsevanja in cisplatina ter na elektrokemoterapijo s cisplatinom. Pomemben rezultat te naloge je tudi, da je elektrokemoterapija z bleomicinom pri obeh celičnih linijah oziroma tumorskih modelih enako učinkovita. V drugem delu naloge, kjer smo raziskovali morebitne mehanizme rezistence, smo dokazali, da radiorezistentne celice poleg zmanjšanega intracelularnega kopičenja cisplatina (v primerjavi s starševsko celično linijo) učinkoviteje popravljajo določene tipe poškodb DNA ter imajo spremenjen spekter izražanja genov za popravilo poškodb DNA. Zaključki: Frakcionirano obsevanje je v radiorezistetni celični liniji sprožilo nekatere mehanizme prilagoditve, kot sta bolj učinkovito popravilo poškodb DNA in navzkrižna rezistenca na cisplatin. V in vivo pogojih so bili FaDu-RR tumorji v primerjavi s FaDu tumorji enako občutljivi na elektrokemoterapijo na osnovi bleomicina, ter bolj odporni na elektrokemoterapijo na osnovi cisplatina. Glede na dejstvo, da je bila ugotovljena razlika med tumorskima modeloma majhna, na osnovi teh rezultatov lahko izključimo pomembnejšo vlogo intrinzične radiorezistence pri slabšem odzivu predhodno obsevanih tumorjev na elektrokemoterapijo. Zaradi navzkrižne rezistence radiorezistentnih celic na cisplatin, bi pri zdravljenju takih tumorjev priporočili elektrokemoterapijo na osnovi bleomicina.20202020-01-24 07:15:13Doktorsko delo/naloga113675sl