Aktivacija izražanja gena Tst z metodo CRISPR/dCas9-VPR v mišji celični linijiLenardič, Ajda (Avtor) Horvat, Simon (Mentor) CRISPR/dCas9-VPRTstNIH3T3debelostsladkorna bolezen tipa 2Debelost in z njo povezana sladkorna bolezen tipa 2 (SBT2)sta med najbolj razširjenimi boleznimi sodobnega časa. Na svetu je 13% odraslih debelih in 39 % prekomerno težkih, za SBT2pa trpi okrog 8 % svetovne populacije. Zaenkrat še ne poznamo učinkovite terapije, ki bi uspešno zdravila ali celo preprečevala obe bolezni, hkrati pa ne bi imela sistemskih oziroma centralnih učinkov.Tst kot eden redkihgenovz dokazano vlogo pri ohranjanju metabolično zdravega fenotipa predstavlja potencialno zelo zanimivo terapevtsko tarčo. Na podlagi predhodno dokazane korelacije med visokim izražanjem Tst in nizkimdeležemmaščevjaternizkim deležem plazemske glukozepri miših in ljudeh smo v diplomskinalogi s sistemom CRISPR/dCas9-VPR poskušali povečati izražanje Tstv trajni celični linijimišjega izvora,NIH3T3.Ta celični model bilahkoslužil kot osnova za nadaljnje raziskovanje in razvoj aplikacij, na primer terapij za zdravljenje SBT2 in debelosti. Potencialno tarčno regijo za vezavo sgRNA na lokusuTst smo izbrali na osnovi bioinformacijskeanalize regulatornih elementov tarčnega gena. Glede na izbrano tarčnoregijosmo zasnovali sgRNA.S cepitvijo DNA in vitro in s testomz vektorjem pCAG-EGxxFP v celicah HEK293 smo dokazali, da se izbrana sgRNA ustrezno veže na tarčno DNA tako in vitro kot v celičnem okolju. Z uspešnim povečanjem izražanja gena Oct4 smo preverili tudi, da proteinska fuzija dCas9-VPR v celicah NIH3T3 deluje ustrezno.Skombinacijo zasnovane sgRNA in proteinske fuzije dCas9-VPR iz vektorja pCMV-dCas9:NLS:VPRsmo natoposkušali povečati izražanje Tst v celicah NIH3T3, vendar statistično značilnega povečanjatranskripcije nismo opazili.Najverjetnejšivzroki za to so prenizka učinkovitost transfekcije, neustrezno izbrana tarčna regija za vezavo sgRNA, odsotnost konstitutivnega izražanja sgRNA zaradi vnosa slednje v sintetični obliki ali pa odsotnostdoločenega transkripcijskega dejavnika, ki je potreben za izražanje gena Tst,vcelicah NIH3T3.Kljub temu, da izražanja Tst nismo uspeli statistično značilnopovečati, smo v diplomskem delu prišli do nekaterih ugotovitev, ki bi lahko služile kot osnova za nadaljnje poskuseregulacije izražanja genov s sistemom CRISPR/dCas9 in s tem pri razvoju terapij za debelost, SBT2 indruge bolezni, ki bi jih bilomogoče zdraviti z regulacijo izražanja endogenih genov.20192020-01-08 12:42:15Diplomsko delo/naloga113450sl