Merjenje poškodb dvoverižne DNA z metodo Comet pri bolnikih s sistemsko sklerozoSukič, Staša (Avtor) Čučnik, Saša (Mentor) Lakota, Katja (Komentor) Sistemska sklerozametoda Cometendogene poškodbe DNAeksogene poškodbe DNApopravljalni mehanizmi DNA.Sistemska skleroza (SSc) je kronična avtoimunska bolezen, za katero je značilno nalaganje kolagena v zunajceličnem matriksu, kar privede do fibrotičnih sprememb kože in notranjih organov. Točen vzrok nastanka bolezni še ni znan, dokazano pa je, da se bolezen razvije pod okoljskimi vplivi ob sočasni genetski predispoziciji, ki pogojuje tudi napredovanje bolezni. Dodatno na razvoj vplivajo še različni patofiziološki procesi, ki so hkrati odgovorni še za heterogeno klinično izražanje bolezni in nastanek specifičnih avtoprotiteles. Pri SSc sta v literaturi opisani povečana genomska nestabilnost in povečano število poškodb DNA, prav tako so pri tako okvarjenih celicah oslabljeni tudi popravljalni mehanizmi. Naš namen je bil preveriti, ali lahko z metodo Comet zaznamo povečane endogene poškodbe dvoverižne DNA pri bolnikih s SSc. Hkrati smo opazovali razliko med nastalo škodo ob izzvani oksidativni poškodbi in sposobnost popravljanja oksidativne poškodbe in vitro v levkocitih bolnikov s SSc v primerjavi z zdravimi kontrolami. Zato smo preverjali obseg poškodb DNA v krvi takoj po odvzemu vzorca, po 30 minutni poškodbi z vodikovim peroksidom in 45 minut po odstranitvi vodikovega peroksida, torej po delovanju popravljalnih mehanizmov DNA. Zaradi enostavnosti izvedbe, velike občutljivosti ter možnosti avtomatizacije smo izbrali metodo Comet, ki nam omogoča oceno obsega poškodb DNA in vitro. Preparate bolnikov s SSc in zdravih kontrol smo pregledovali pod mikroskopom ter jih tako ovrednotili semikvantitativno in avtomatsko s programom OpenComet, ki slike preparatov ovrednoti kvantitativno preko več parametrov. Najpomembnejši za oceno poškodb DNA so parametri za opredelitev značilnosti repa kometa, torej dolžina repa, odstotek DNA v repu, repni moment in olivni moment. Preverjali smo tudi skladnost ročnega in avtomatiziranega pregleda ter povezavo med starostjo, spolom, prisotnostjo specifičnih avtoprotiteles ter številom prelomov dvoverižne DNA in sposobnostjo popravljanja. Ugotovili smo, da semikvantitativno in kvantitativno vrednotenje kometov pri metodi Comet dobro korelirata. Obseg endogenih poškodb dvoverižne DNA, ugotovljen z metodo Comet, se statistično značilno ne razlikuje med celotno skupino bolnikov s SSc in kontrolno skupino zdravih. Količine endogenih poškodb dvoverižne DNA in izzvanih eksogenih poškodb dvoverižne DNA so statistično značilno večje pri starejših kontrolah kot pri zdravih mlajših posameznikih. S starostjo pri kontrolah pade učinkovitost popravljalnih mehanizmov DNA, saj smo pri starejših kontrolah neodvisno od spola dokazali statistično značilno daljši repni moment. Pri bolnikih s SSc ne dokažemo povezav med starostjo in številom endogenih poškodb dvoverižne DNA, prav tako ni statistično značilne povezave med starostjo bolnikov s SSc in številom izzvanih poškodb dvoverižne DNA po nanosu vodikovega peroksida ali po delovanju popravljalnih mehanizmov DNA. Med bolniki s SSc s prisotnimi specifičnimi protitelesi proti topoizomerazi ① in s prisotnimi specifičnimi anti-centromernimi protitelesi smo dokazali statistično značilne razlike v repnem momentu. To kaže na razlike v številu endogenih poškodb dvoverižne DNA, ki jih je več pri skupini bolnikov s SSc s prisotnimi anti-centromernimi protitelesi.20192019-12-21 08:35:24Magistrsko delo/naloga113349sl