Razvoj mlečnokislinske bakterije Lactococcus lactis s sposobnostjo dostave proteinskih ligandov receptorja za interlevkin 23Benko, Anja (Avtor) Berlec, Aleš (Mentor) Lactococcus lactiskronična vnetna črevesna bolezenpovršinska predstavitevrekombinantni proteiniKronično vnetno črevesno bolezen (KVČB) delimo na ulcerozni kolitis ter Crohnovo bolezen. Za obe obliki je vzrok prekomerna aktivacija imunskega odziva v sluznici črevesja, pri čemer pomembno vlogo igra citokinska os IL-23/Th17. Trenutno zdravljenje poteka sistemsko z aminosalicilati, imunosupresivi, kortikosteroidi, pri najhujših oblikah pa s protitelesi proti različnim tarčam v procesu vnetnega odziva. Ker imajo protitelesa visoko ceno, veliko neželenih učinkov ter pri velikem deležu bolnikov niso učinkovita, poteka razvoj majhnih proteinov z visoko afiniteto vezave, specifičnostjo ter sposobnostjo inhibicije vnetja. V okviru magistrskega dela smo uporabili rekombinantne proteine REX009, REX115 in REX125 s potrjenim antagonističnim delovanjem na receptor za IL-23 in jih nadgradili s tarčno dostavo. Kot dostavni sistem smo izbrali mlečnokislinske bakterije Lactococcus lactis, saj imajo status GRAS (Generally recognized as safe) in pripomorejo k vzpostavitvi normalne mikrobiote v sluznici črevesja. Cilj je bil pripraviti bakterije s sposobnostjo izločanja proteinov REX v gojišče in bakterije s sposobnostjo površinske predstavitve proteinov REX. Za pripravo plazmidov z genskimi konstrukti REX smo uporabili plazmide pNZ8148, pSDBA3b in pGEM-T Easy. Končni plazmidi so bili pripravljeni v ogrodju plazmida pSDBA3b, ki omogoča z nizinom nadzorovano izražanje genov, z dodanimi geni za signalni peptid Usp45, označevalni peptid Flag, protein REX ter površinsko sidro cAcmA. V procesu priprave končnih konstruktov smo genske fragmente pomnoževali s PCR, jih ločevali z agarozno gelsko elektroforezo ter jih v plazmide vstavljali z restrikcijo in ligacijo. Plazmide smo analizirali s postopkom PCR na kolonijah in z določanjem nukleotidnega zaporedja ter s preverjenimi transformirali bakterije. Izražanje proteinov REX smo preverili po ločevanju s postopkom NaDS PAGE, in sicer s metodama prenosa po westernu ter z barvanjem z barvilom Commassie Brilliant Blue. Izločanje proteinov REX ter obseg njihove površinske predstavitve smo preverili s pretočno citometrijo. Potrdili smo uspešno vezavo na receptor za IL-23 za vse površinsko predstavljene proteine REX, pri čemer smo opazili najmočnejšo vezavo s proteinom REX125. Ob tem smo ugotovili tudi negativen vpliv sklopitve z označevalnim peptidom Flag na obseg vezave. Dodatno smo opravili modificiran test ELISA, s katerim smo potrdili prisotnost izločenih proteinov REX v gojišču in njihovo sposobnost vezave na imobiliziran receptor IL-23R, pri čemer je največji obseg vezave izkazal protein REX009. V raziskavi smo tako potrdili zmožnost rekombinantnih bakterij za dostavo vezalcev receptorja IL-23R, njihovo terapevtsko učinkovitost pa bo potrebno ovrednotiti na živalskem modelu KVČB.20192019-12-18 08:35:03Magistrsko delo/naloga113277sl