Razvoj analiznih metod za določevanje analitov v meduJakše, Helena (Avtor) Kolar, Mitja (Mentor) Novinec, Marko (Komentor) medkovineICP-OESpeptididefenzin-1apisiminNaDS-PAGEMed je naravni kompleksni produkt čebel, ki nastane s procesiranjem nektarja ali mane. Sestavljen je iz vode, različnih sladkorjev, proteinov, organskih kislin, anorganskih mineralov in kovinskih kationov v sledovih. Prav slednji bi lahko služili za okoljski monitoring, saj lahko z določanjem njihove koncentracije v medu iz različnih geografskih območij spremljamo onesnaženost okolja. V medu se v manjših količinah nahajajo tudi proteini in peptidi, ki s svojim specifičnim biološkim delovanjem prispevajo k farmakološkim aktivnostim medu. Peptidi s protimikrobnim delovanjem so predvsem čebeljega izvora, torej izločki njihovih hipofaringealnih žlez, ki presnavljajo surovi med. Da bi lahko vzpostavili uporabne modele za določevanje botaničnega izvora medu in okoljskega monitoringa, smo med različnega botaničnega in geografskega porekla analizirali z optično emisijsko spektroskopijo z induktivno sklopljeno plazmo (ICP-OES). Na podlagi pridobljenih rezultatov smo skušali najti povezavo med vsebnostjo kovin in okoljskim onesnaženjem. Izkazalo se je, da obstaja povezava med vsebnostjo svinca in aluminija glede na vsebnost antimikrobnih peptidov v medu. Za preučevanje peptidov v medu je pomembna njihova dobra ločba in vizualizacija. Osredotočili smo se na peptide manjše od 10 kDa, izmed katerih jih ima veliko tudi biološke učinke. Optimizirali smo nov protokol za poliakrilamidno gelsko elektroforezo z dodatkom natrijevega dodecilsulfata (NaDS-PAGE). Klasična metoda na osnovi glicinskega pufrskega sistema ni primerna, zato smo uporabili tricinski pufer. Poleg tega barvanje z Coomasssie Brillliant Blue barvilom ni primerno za vizualizacijo peptidov nizkih koncentracij zaradi prenizke občutljivosti, zato smo uporabili in optimizirali barvanje s srebrovim barvilom. Tako smo uspešno ločili peptidni lisi velikosti 5 in 7 kDa. Na osnovi literature sklepamo, da peptidno liso velikosti 5 kDa predstavljata defenzin-1 in apisimin. Kateri proteini naj bi sestavljali peptidno liso velikosti 7 kDa iz literature ni bilo moč ugotoviti, saj kolikor je nam znano, omenjena proteinska lisa v medu še ni bila opažena in predstavlja pomembno novost našega raziskovalnega dela. Eksperimentalne rezultate smo kvantificirali v programu QuantityOne (Bio-Rad, ZDA) in pri tem kot pozitivno kontrolo uporabili matični mleček, saj vsebuje visoko vsebnost defenzina-1 in apisimina. Koncentracijo peptidnih lis smo podali kot ekvivalent ustrezne proteinske lise v znani količini matičnega mlečka. Rezultati so pokazali, da v referenčnem matičnem mlečku najdemo proteinsko liso 5 kDa, ne pa tudi 7 kDa. Nasprotno je v medu proteinska lisa 5 kDa prisotna v zgolj v sledovih, več pa je proteinske lise 7 kDa. Obe se v medu pojavljata neodvisno od njegovega geografskega in botaničnega izvora, saj med posameznimi kategorijami nismo določili statistično značilnih razlik.20192019-12-16 12:50:06Magistrsko delo/naloga113240sl